غالبا ما تتم دراسة تأثير العوامل البيئية الدقيقة على سلوك الخلية باستخدام منصات مبسطة للغاية في المختبر ، والتي تعزل الإشارات المفردة. نهجنا يخلق ركائز زراعة الخلايا التي تجمع بين العديد من هذه الإشارات. هذا النهج متعدد الاستخدامات للغاية ويتيح إجراء دراسة منهجية باستخدام مجموعة واسعة من مواد زراعة الخلايا وأنماط توجيه الاتصال والقراءات الخلوية والبروتينات.
سيتم عرض الإجراء من قبل اثنين من مرشحي PSE من مختبرنا. يقوم CAS VAN DER PUTTEN ، و MIRKO D'URSO FIRST ، بإنشاء قالب زجاجي سلبي باستخدام تقنية FEMTOSECOND Laser Direct Right التي تحتوي على جميع الميزات المثيرة للاهتمام. ثم ، ضع القالب الزجاجي السلبي بعناية في الجزء السفلي من طبق بتري وصب بوليمر البولي ثنائي ميثيل سيلوكسان المسبق فوق القالب الزجاجي السلبي لتغطيته بالكامل.
ضع هذا الطبق البتري في مجفف الفراغ وابدأ تشغيل مضخة التفريغ. بمجرد تحقيق فراغ ، انتظر لمدة 5 دقائق لإزالة جميع الفقاعات الموجودة في الواجهة بين سطح القالب وبوليمر البولي ثنائي ميثيل سيلوكسان المسبق. عالج البوليمر المسبق PDMS بين عشية وضحاها في الفرن عند 65 درجة مئوية.
بعد المعالجة ، استخدم ملعقة لرفع حواف PDMS. قم بإزالة شريحة PDMS الإيجابية التي تم علاجها حديثا من القالب الزجاجي السلبي ، وإذا كانت شريحة PDMS الإيجابية تميل إلى الالتصاق بالقالب الزجاجي السلبي ، فأضف الإيثانول أو الماء إلى حواف البصمة أثناء الرفع. ثم ، ضع شريحة Polydimethylsiloxane الإيجابية في مجفف بجوار قارورة صغيرة مع قطرة من عامل السيلانات ، واترك الشريحة تحت الفراغ بين عشية وضحاها.
صب PDMS قبل البوليمر في قالب PDMS السلبي لإنتاج رقائق زراعة خلايا متعددة بسماكة 5 ملليمتر. بعد ذلك ، قم بإزالة الفقاعات باستخدام المجفف وعلاجها لمدة ثلاث ساعات عند 65 درجة مئوية. استخدم شفرة حلاقة لقطع الشريحة إلى الحجم النهائي وتخزين الرقائق في درجة حرارة الغرفة لتخميل الركيزة باستخدام ملاقط ، ضع الشريحة في سلة البلازما Asher.
ثم ، استخدم بلازما الأكسجين لتنشيط مجموعات الهيدروكسيل على سطح الشريحة وتنفيس غرفة الرماد باستخدام النيتروجين. أخرج الشريحة من السلة وضعها في حاوية صغيرة من Polydimethylsiloxane. الآن ، استخدم ماصة باستور لإضافة 500 ميكرولتر من Poly-L-lysine في الجزء العلوي من الشريحة ، لغمر السطح بالكامل في المحلول واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ثم ، قم بإزالة 450 ميكرولتر من Poly-L-lysine من شريحة زراعة الخلايا باستخدام ماصة. بعد ذلك ، شطف ثلاثي سطح الرقاقة باستخدام 500 ميكرولتر من 0.1 مخزن مؤقت HEPES مولي. حافظ على جودة النمط النهائي عن طريق ترك كمية صغيرة من السائل على رقاقة Polydimethylsiloxane ، لمنع تجفيف العينة.
قبل الاستخدام مباشرة ، قم بإعداد 500 ميكرولتر من 50 ملليغرام لكل محلول ميثوكسي بولي إيثيلين جليكوسيك سياناميديل فاليرات في 0.1 أكوام مولية عازلة لكل رقاقة زراعة الخلايا واحتضن العينة فيها لمدة 60 دقيقة. باستخدام ماصة صغيرة ، قم بإزالة 450 ميكرولتر من محلول ميثوكسي بولي إيثيلين جليكوسيك سياناميدال فاليرات. اغسل سطح الشريحة خمس مرات باستخدام PBS عن طريق السحب للداخل والخارج.
لإزالة كافة mPEG-SVA غير المنضمة. ضع الشريحة الزجاجية باستخدام أداة تمييز فلورسنت في المسار البصري للمجهر. قم بالتبديل إلى وضع الفلورسنت على المجهر وركز بعناية على الصورة الأولية ، مما يضمن أن يكون كل من الشعار والنص في بؤرة التركيز.
انقر فوق التالي لرؤية بيانات المعايرة ونمطها لإنهاء إجراء المعايرة. اكتب موقع Z للمرحلة عند المعايرة واستخدم هذا الموقع كمرجع لاحقا في البروتوكول. بعد إزالة شريحة المعايرة من المرحلة ، ضع شريحة زجاجية تحتوي على قطرة من بادئ الصورة على المسرح وضع ركيزة ثقافة خلية PDMS رأسا على عقب ، في قطرة بادئ الصورة.
تأكد من أن ميزات 3D على سطح الركيزة ثقافة الخلية تواجه الشريحة الزجاجية ومغمورة بالكامل في بادئ الصورة ، لضمان النقش المناسب. ركز على الجزء العلوي أو السفلي من الهياكل المحدبة أو المقعرة على التوالي وركز على منطقة الشريحة في الموقع الصحيح كما هو موضح في المخطوطة. اضبط إعدادات النقش وفقا للميزة وحدد جرعة 1000 مللي جول لكل ملليلتر.
انقر فوق زر التشغيل في الجزء السفلي الأيمن من الشاشة لبدء النقش. بمجرد الانتهاء ، لاحظ النمط المعروض باللون الأخضر. باستخدام ماصة صغيرة ، أضف ملليلترين من PBS إلى قارورة من 20 ميكروغرام من الرودامين المسمى fibronectin ، للحصول على تركيز 10 ميكروغرام لكل ملليلتر.
ماصة بلطف لتجنب كتل البروتين والحماية من الضوء. باستخدام ماصة صغيرة ، أضف 200 إلى 500 ميكرولتر من محلول البروتين إلى شريحة زراعة الخلايا. اضبط وقت الحضانة ودرجة الحرارة اعتمادا على البروتين الذي تختاره ، وتأكد من تغطية العينة.
قم بإزالة محلول البروتين واغسل الشريحة خمس مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS المعقم. تأكد من ماصة PBS لأعلى ولأسفل عدة مرات فوق كل الميزات ذات الصلة لشريحة زراعة الخلايا ، لإزالة أي بروتين غير مقيد. بمجرد إعداد تعليق الخلية ، قم بإزالة PBS وإضافة 1 ملليلتر من تعليق الخلية إلى الشريحة.
ثم احتضنه لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تحقق من التصاق الخلايا على رقاقة زراعة الخلايا تحت مجهر حقل مشرق. ابحث عن مورفولوجيات الخلايا الممدودة في حالة أنماط الخط.
وإذا بدأت الخلايا في الالتصاق خارج المنطقة المنقوشة ، فقم بإزالتها عن طريق سحب الوسط لأعلى ولأسفل مباشرة فوق الخلايا الموجودة على الركيزة. بعد التلطيخ ، ضع العينة الملونة رأسا على عقب في قطرة من PBS على شريحة زجاجية. بعد ذلك ، اعتمادا على المستوى المطلوب من التفاصيل ، قم بعمل مكدسات Z بهدف مناسب وتباعد Z لضمان الحصول على الصورة بشكل صحيح.
قم بإنشاء عرض ثلاثي الأبعاد لمكدس Z باستخدام برنامج تقديم 3D. تم نقش حفرة مقعرة باستخدام الامتصاص الجزيئي الناجم عن الضوء للبروتينات وتم تصور أقصى كثافة للإسقاط والرؤية المتعامدة. أظهر ملف تعريف الكثافة انتقالات حادة عالية الدقة بين المناطق المنقوشة وغير المنقوشة وكثافة البروتين المتسقة.
أظهر النقش باستخدام المستوى البؤري الفردي بالإضافة إلى طريقة مستويين بؤريين وثلاثة محاذاة مثالية للأنماط الموجودة أعلى الميزات. تم نقش الأسطوانات شبه المقعرة والأسطوانات شبه المحدبة وسطح السرج و PID باستخدام خطوط أو دوائر متحدة المركز بعروض مختلفة. يتم تلطيخ التأثير داخل الهيكل العظمي للخلايا القرنية البشرية باستخدام أوراق الشجر وتصوره.
تم استزراع الخلايا الليفية الجلدية على أسطوانة شبه مقعرة منقوشة وتصورها. استشعرت الخلايا والتزمت بركيزة زراعة الخلايا متعددة الإشارات وظلت قابلة للحياة بمرور الوقت كما تصورها F-actin و Vinculin و Nuclei. أيضا ، شكلت الخلايا التصاقات بؤرية بشكل رئيسي على خطوط الفيبرونيكتين.
التزمت الخلايا الليفية الجلدية البشرية المستزرعة على أسطوانة مقعرة منقوشة في وجود الفيبرونيكتين الرودامين بالركيزة متعددة الإشارات وأظهرت استجابة محاذاة ، وفقا لنمط توجيه الاتصال. يتم الحفاظ على استجابة المحاذاة وجدوى الخلية طوال مدة المزرعة بأكملها. أهم شيء عند تنفيذ هذا البروتوكول هو منع سطح شريحة زراعة الخلايا من الجفاف.
قد يتطلب استخدام مواد الركيزة المختلفة وطلاءات البروتين وأنواع الخلايا تحسينا إضافيا. توفير إشارات بيئية متعددة في 3D يمكن أن يفتح إمكانيات جديدة لتوجيه التنظيم الخلوي في الأنسجة الهندسية المعقدة.
