تم تمويل هذا البحث من قبل لجنة ولاية نيو جيرسي في الحبل الشوكي البحوث (NJCSCR) (لFHK)، منح CSCR14IRG005 (لBLF)، المعاهد الوطنية للصحة منح R15NS087501 (لCHC)، ومؤسسة كيربي FM (لايتا).

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى جميع بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. بعض المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول سامة ومسرطنة. الرجاء استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة (غطاء الدخان، صندوق قفازات) ومعدات الوقاية الشخصية (النظارات الواقية والقفازات ومعطف المختبر، كامل طول السراويل والأحذية المغلقة اصبع القدم) عند استخدام المواد السامة أو حمض / قاعدة. 1. تصنيع ماستر لقوالب لينة الطباعة الحجرية باستخدام الطباعة التصويرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم تخطيط متناهية باستخدام أداة رسم التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طباعة تخطيط على طبق من ذهب قناع فارغة باستخدام الكاتب قناع الليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف رقاقة السيليكون 4 بوصة مع الأسيتون تليها الأيزوبروبانول والجافة مع بندقية الهواء النيتروجين لضمان عدم ترك أي مذيب على الرقاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى رقاقة عن طريق الخبز على طبق ساخن على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر مقاومة للضوء سلبي مصممة للارتفاع المطلوب من و microchannels. Fأو سبيل المثال، استخدم مقاومة للضوء سلبي SU-8 50 للحصول على microchannels مع ارتفاع 50 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الرقاقة ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة، ثم محاذاة رقاقة على ظرف من المغطي تدور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن 4 مل (1 مل / بوصة قطر الرقاقة) من مقاومة للضوء سلبي على مركز الرقاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور معطف الرقاقة مع دورة تدور على مرحلتين باستخدام الدوار. أولا، وتطبيق دورة انتشار 500 دورة في الدقيقة مع تسارع من 100 دورة في الدقيقة / ثانية لمدة 10 ثانية. ثم تطبيق دورة دوران 2000 دورة في الدقيقة مع تسارع من 300 دورة في الدقيقة / ق 2 لمدة 30 ثانية للحصول على طلاء 50 ميكرون من مقاوم الضوء على رقاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خبز لينة الرقاقة في خطوتين على طبق ساخن وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. لطلاء 50 ميكرون من مقاومة للضوء، لأول مرة قبل خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 6 دقائق ثم المنحدر فورا درجة الحرارة صفيحة ساخنة لمرحلة ما بعد خبز الرقاقة عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الرقاقة ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة ثم تحميلرقاقة على خشبة المسرح الطباعة الحجرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة قناع على الرقاقة باستخدام قناع اليجنر وفضح الرقاقة للأشعة فوق البنفسجية (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) في كثافة من 1.5 ميغاواط / سم 2 ل 146 ق لتطبيق الجرعة الكلية للأشعة فوق البنفسجية من 220 ميغا جول / سم 2 المطلوبة ل 50 ميكرون طبقة سميكة من مقاومة للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق بعد التعرض خبز إلى رقاقة في خطوتين على طبق ساخن. لطلاء 50 ميكرون من مقاومة للضوء، لأول مرة قبل خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وعلى الفور تكثيف درجة الحرارة صفيحة ساخنة لمرحلة ما بعد خبز أنه في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطوير رقاقة في قبل غمر الرقاقة في SU-8 المطور ويهز بلطف حتى تصبح ملامح واضحة على الرقاقة. تطوير رقاقة ل~ 6 دقائق للمقاومة للضوء سميكة 50 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف المطور الزائد مع الأيزوبروبانول والإيثانول، ثم تجفيف رقاقة مع بندقية الهواء النيتروجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من الصعب خبز رقاقة السيليكون على طبق ساخن على 150 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الرقاقة في مجفف مع 25 ميكرولتر من وكيل silanizing tridecafluoro-1،1،2،2-tetrahydrooctyl-1-trichlorosilane. ملاحظة: عامل silanizing غير قابلة للتآكل، وبالتالي ينبغي أن تستخدم في غطاء الدخان حمض / قاعدة، مع معدات الحماية الشخصية المناسبة (نظارات السلامة، والقفازات، معطف المختبر، كامل طول السراويل مغلقة اصبع القدم أحذية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق فراغ لمدة 5 دقائق وفضح الرقاقة لأبخرة من سيلاني لمدة 30 دقيقة دون الإفراج عن فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل رقاقة في طبق بيتري الحجم بشكل مناسب. </li></ol> 2. تصنيع ماستر لقوالب لينة الطباعة الحجرية باستخدام شريط لاصق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم تخطيط متناهية باستخدام أداة رسم CAD وطباعة الرسم على ورقة بيضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف شريحة زجاجية كبيرة بما يكفي لاستيعاب تصميم مع الأيزوبروبانول ثم تجف الشريحة مع بندقية الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق شريط لاصق على الشريحة الزجاجية تنظيفها. يجب الحرص على عدم اعتراض أي فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريط جانبي GLASS تنزلق على ورقة مع تصميم ومع الشريط لأعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مشرط لقطع الشريط على شريحة زجاجية باستخدام تصميم ورقة كمرجع ثم تقشر الشريط من المناطق غير المرغوب فيها من شريحة زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الشريحة الزجاجية مع الأيزوبروبانول وجاف ثم مع بندقية الهواء. خبز الشريحة الزجاجية في فرن عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفة بلطف على الشريط مع بكرة مطاطية لإزالة فقاعات الهواء والسماح الشريحة ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة. </li></ol> 3. لينة الطباعة الحجرية تصنيع الأجهزة PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج PDMS المطاط الصناعي وكيل علاج في نسبة 10: 1 (ث: ث)، وتحريك الخليط بقوة، ثم ديغا الخليط عن طريق وضعها في غرفة فراغ حتى لا تظهر فقاعات الهواء في الخليط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصب الخليط على قالب السيليكون silanized أو العفن شريط لاصق في طبق بتري للحصول على طبقة سميكة من PDMS وديغا و~ 2 مم حتى عن الهواء تختفي فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج PDMS في فرنعند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مشرط لقطع طبقة PDMS 5 مم على الأقل بعيدا عن الميزات وثم قشر PDMS شفي من العفن باستخدام الملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكمة ثقب مدخل واحد مع خزعة 1 مم لكمة في أي مكان على متناهية، ويفضل أن يكون في نهاية شبكة من microchannels كما رأينا في الشكل 2A و 4B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف PDMS يلقي بشريط لاصق لإزالة جزيئات الغبار كثف على الجهاز. تعقيم الجهاز متناهية PDMS (PDMS الزهر) قبل الشطف بمحلول مكون من 70٪ من الإيثانول تليها منزوع الأيونات معقمة الماء (DI)، وفضح للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على جهاز PDMS العقيمة في طبق بتري معقمة حتى الاستخدام. </li></ol> 4. الركيزة الزخرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع PDMS العقيمة يلقي باستخدام الملقط على ساترة زجاجية معقمة أو طبق بتري وتطبيق ضغط لطيف باستخدام غيض من ملاقط. ملاحظة: يلقي PDMS يجعل امتثالي لكن ختم عكسها مع GLساترة الحمار أو طبق بتري تشكيل microchannels دون استخدام أية مواد لاصقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة (20 - 40 ميكرولتر) من الحل الركيزة على مدخل تغطي تماما ثقب مدخل. نمط بولي-D-ليسين (PDL) عن طريق وضع قطرات 20 ميكرولتر من PDL في المخزن بورات ثنائي الصوديوم على مدخل و microchannels. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق بتري في فراغ من ~ 254 mmHgA (أي ما يعادل لإيواء فراغ في المختبرات البيولوجية) لمدة 10 دقيقة، ومراقبة الهواء يخرج من القناة على شكل فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الافراج عن فراغ ومراقبة الحل الركيزة التي تصب في متناهية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان طبق في الظروف الملائمة لالتزام الركيزة. انظر الجدولين 1 و 2 للشروط الحضانة (وهذه تختلف تبعا الركيزة). لPDL الزخرفة، واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقشر بعناية الطابع PDMS باستخدام الملقط معقمة وغسل نمط على ساترة الزجاج ثلاث مرات بالماء DI. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة محلول 1٪ زلال المصل البقري (BSA) إلى طبق بتري لتغطية صحن أو الزجاج ساترة واحتضان ليلا 37 درجة مئوية. ملاحظة: هذا سوف يقلل التزام غير محددة في مناطق غير المصقول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة حل جيش صرب البوسنة 1٪، والركيزة نمط هو الآن جاهزة للاستخدام. </li></ol> 5. الزخرفة غير المباشرة من الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعليق خلية في مستنبت المصل خالية. يتم سرد نوع من الخلايا وكثافة الخلايا في الجدول 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تعليق الخلية إلى طبق بيتري منقوشة تماما وغمر المنطقة نقوش في تعليق خلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان طبق بتري عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 15 دقيقة للسماح للخلايا لنعلق على الركيزة المزخرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح تعليق الخلية الزائدة من طبق بيتري وغسل الخلايا نمط ثلاث مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، في حين تهز برفق لمدة 10 ثانية لإزالة الخلايا غير مرتبط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة لمستنبت ppropriate على ثقافات خلية نمط واحتضان خلايا نمط عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2. </li></ol> 6. الزخرفة المباشرة للخلايا ملاحظة: هذه التقنية كبديل لتنميط الخلية غير المباشرة هو موضح في الخطوة 5. ومع ذلك، خلافا لما حدث في الخطوة 5، في هذه التقنية على نمط الخلايا على الأسطح زراعة الأنسجة مع أو بدون طلاء الركيزة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الجهاز ميكروفلويديك قبل الشطف بمحلول مكون من 70٪ من الإيثانول تليها مياه DI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع الجهاز بين عشية وضحاها في حل من 1٪ BSA لمنع التصاق الخلية إلى PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف الجهاز في درجة حرارة الغرفة وضمها الى الجزء السفلي من طبق بتري تعامل ثقافة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعليق خلية في وسائل الإعلام ثقافة خالية من المصل. يتم سرد نوع من الخلايا وكثافة الخلايا في الجدول 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة (4-8 ميكرولتر) لتعليق الخلية، وهو ما يكفي لملءmicrochannels، على مدخل تغطي تماما ثقب مدخل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق بتري في فراغ لمدة 10 دقيقة ومراقبة الهواء يخرج من القناة على شكل فقاعات. الافراج عن فراغ ومراقبة تعليق الخلية التي تصب في متناهية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان طبق بتري في حاضنة لتعزيز التصاق الخلايا وفقا للشروط الحضانة (تعتمد على نوع من الخلايا نمط) المذكورة في الجدول 2. إضافة برنامج تلفزيوني على طبق بتري غمر الجهاز PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر PDMS بعناية قبالة طبق بتري مع ملاقط وغسل النمط مع برنامج تلفزيوني. إضافة وسائط الثقافة الخلية إلى طبق بتري ومكان زراعة الخلايا في الحاضنة. </li></ol>

<ol>
	<li>Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+proteins+and+cells+using+soft+lithography.">Patterning proteins and cells using soft lithography.</a> Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).</li><li>Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis+based-cell+patterning+for+tissue+engineering.">Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering.</a> Biotechnol J. 1 (9), 949-957 (2006).</li><li>Veiseh, M., Zareie, M. H., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Selective+Protein+Patterning+on+Gold-Silicon+Substrates+for+Biosensor+Applications.">Highly Selective Protein Patterning on Gold-Silicon Substrates for Biosensor Applications.</a> Langmuir. 18 (17), 6671-6678 (2002).</li><li>Kung, F., Wang, J., Perez-Castillejos, R., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+along+the+nasal/temporal+plane+affects+synaptic+development+by+adult+photoreceptors,+revealed+by+micropatterning.">Position along the nasal/temporal plane affects synaptic development by adult photoreceptors, revealed by micropatterning.</a> Integr Biol. 7 (3), 313-323 (2015).</li><li>Dickinson, L. E., Lutgebaucks, C., Lewis, D. M., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+microscale+extracellular+matrices+to+study+endothelial+and+cancer+cell+interactions+in+vitro.">Patterning microscale extracellular matrices to study endothelial and cancer cell interactions in vitro.</a> Lab Chip. 12 (21), 4244-4248 (2012).</li><li>Khademhosseini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+human+embryonic+stem+cells+with+murine+embryonic+fibroblasts+on+microwell-patterned+substrates.">Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates.</a> Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnol J. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Choi, Y., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+cell+growth+through+surface+treatments.">Guided cell growth through surface treatments.</a> J of Mech Sci Technol. 19 (11), 2133-2137 (2005).</li><li>Hwang, I. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Immobilization+and+Patterning+of+Biomolecules+on+Poly(ethylene+terephthalate)+Films+Functionalized+by+Ion+Irradiation+for+Biosensor+Applications.">Efficient Immobilization and Patterning of Biomolecules on Poly(ethylene terephthalate) Films Functionalized by Ion Irradiation for Biosensor Applications.</a> ACS Appl Mater Interf. 3 (7), 2235-2239 (2011).</li><li>Clark, P., Britland, S., Connolly, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+guidance+and+neuron+morphology+on+micropatterned+laminin+surfaces.">Growth cone guidance and neuron morphology on micropatterned laminin surfaces.</a> J Cell Sci. 105 (1), 203-212 (1993).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> J Cell Sci. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Douvas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+photolithographic+process+for+the+patterning+of+biomolecules.">Biocompatible photolithographic process for the patterning of biomolecules.</a> Biosens Bioelectron. 17 (4), 269-278 (2002).</li><li>Alom, R. S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing:+A+tool+to+pattern.">Microcontact printing: A tool to pattern.</a> Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).</li><li>Ess&#246;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifying+Polydimethylsiloxane+(PDMS)+surfaces.">Modifying Polydimethylsiloxane (PDMS) surfaces.</a> Institutionen f&#246;r biologi och kemiteknik. , (2007).</li><li>Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+PDMS+surface+modification+for+microfluidic+devices.">Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices.</a> Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).</li><li>Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+elastomeric+stencils+for+micropatterning+cell+cultures.">Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures.</a> J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).</li><li>Yeo, W. S., Yousaf, M. N., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+interfaces+between+cells+and+surfaces:+electroactive+substrates+that+sequentially+release+and+attach+cells.">Dynamic interfaces between cells and surfaces: electroactive substrates that sequentially release and attach cells.</a> J Am Chem Soc. 125 (49), 14994-14995 (2003).</li><li>Bhatia, S. N., Toner, M., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adhesion+of+hepatocytes+on+patterned+surfaces.">Selective adhesion of hepatocytes on patterned surfaces.</a> Ann N Y Acad Sci. 745, 187-209 (1994).</li><li>Song, E., Kim, S. Y., Chun, T., Byun, H. -. J., Lee, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+scaffolds+derived+from+a+marine+source+and+their+biocompatibility.">Collagen scaffolds derived from a marine source and their biocompatibility.</a> Biomaterials. 27 (15), 2951-2961 (2006).</li><li>Yamato, M., Konno, C., Utsumi, M., Kikuchi, A., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+responsive+polymer-grafted+surfaces+facilitate+patterned+cell+seeding+and+co-culture.">Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture.</a> Biomaterials. 23 (2), 561-567 (2002).</li><li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+cells+and+their+environments+using+multiple+laminar+fluid+flows+in+capillary+networks.">Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (10), 5545-5548 (1999).</li><li>Kim, D. S., Lee, K. -. C., Kwon, T. H., Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-channel+filling+flow+considering+surface+tension+effect.">Micro-channel filling flow considering surface tension effect.</a> J of Micromech Microeng. 12 (3), 236 (2002).</li><li>Kim, E., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromolding+in+Capillaries:+Applications+in+Materials+Science.">Micromolding in Capillaries: Applications in Materials Science.</a> J Am Chem Soc. 118 (24), 5722-5731 (1996).</li><li>Kim, E., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Microstructures+Formed+by+Molding+in+Capillaries.">Polymer Microstructures Formed by Molding in Capillaries.</a> Nature. 376 (6541), 581-584 (1995).</li><li>Jeon, N. L., Choi, I. S., Xu, B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-area+patterning+by+vacuum-assisted+micromolding.">Large-area patterning by vacuum-assisted micromolding.</a> Adv Mater. 11 (11), 946 (1999).</li><li>Shrirao, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+and+method+for+novel+microfluidic+device.">System and method for novel microfluidic device.</a> US patent. , (2010).</li><li>Merkel, T. C., Bondar, V. I., Nagai, K., Freeman, B. D., Pinnau, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+sorption,+diffusion,+and+permeation+in+poly(dimethylsiloxane).">Gas sorption, diffusion, and permeation in poly(dimethylsiloxane).</a> J Polym Sci Part B Polym Phys. 38 (3), 415-434 (2000).</li><li>Shrirao, A. B., Hussain, A., Cho, C. H., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive-tape+soft+lithography+for+patterning+mammalian+cells:+application+to+wound-healing+assays.">Adhesive-tape soft lithography for patterning mammalian cells: application to wound-healing assays.</a> Biotechniques. 53 (5), 315-318 (2012).</li><li>Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chips+&amp;+tips:+simple+fabrication+of+microfluidic+devices+by+replicating+scotch-tape+masters.">Chips &amp; tips: simple fabrication of microfluidic devices by replicating scotch-tape masters.</a> Lab Chip. , (2010).</li><li>Anil, B. S., Frank, H. K., Derek, Y., Cheul, H. C., Ellen, T. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuum-assisted+fluid+flow+in+microchannels+to+pattern+substrates+and+cells.">Vacuum-assisted fluid flow in microchannels to pattern substrates and cells.</a> Biofabrication. 6 (3), 035016 (2014).</li><li>Yuen, P. K., Goral, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+rapid+prototyping+of+flexible+microfluidic+devices+using+a+desktop+digital+craft+cutter.">Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter.</a> Lab on a Chip. 10 (3), 384-387 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-loading+and+cell+culture+in+one+layer+microfluidic+devices.">Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices.</a> Biomed Microdevices. 11 (3), 679-684 (2009).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mammalian+cells+under+high+vacuum+condition+for+ion+bombardment.">Survival of mammalian cells under high vacuum condition for ion bombardment.</a> Cryobiology. 49 (3), 241-249 (2004).</li><li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+bonding+by+means+of+a+portable,+low-cost+corona+system.">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li><li>Fan, D. -. H., Yuan, S. -. W., Shen, Y. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modification+with+BSA+blocking+based+on+in+situ+synthesized+gold+nanoparticles+in+poly+(dimethylsiloxane)+microchip.">Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly (dimethylsiloxane) microchip.</a> Colloids Surf, B. 75 (2), 608-611 (2010).</li><li>Hideshima, S., Sato, R., Inoue, S., Kuroiwa, S., Osaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+tumor+marker+in+blood+serum+using+antibody-modified+field+effect+transistor+with+optimized+BSA+blocking.">Detection of tumor marker in blood serum using antibody-modified field effect transistor with optimized BSA blocking.</a> Sens Actuator B-Chem. 161 (1), 146-150 (2012).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+immunoassay+through+in-channel+microfluidic+patterning.">High-throughput immunoassay through in-channel microfluidic patterning.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2487-2490 (2012).</li><li>MacLeish, P., Barnstable, C., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+monoclonal+antibody+as+a+substrate+for+mature+neurons+in+vitro.">Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro.</a> Procs Nat Acad of Sci. 80 (22), 7014-7018 (1983).</li><li>Suchodolskis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+chemically+modified+baker's+yeast+cells+studied+by+AFM.">Elastic properties of chemically modified baker's yeast cells studied by AFM.</a> Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

في حين ضوئيه التقليدية هي تقنية راسخة لإنشاء قوالب للالطباعة الحجرية الناعمة والمعدات والمواد والمهارات اللازمة لاستخدام ضوئيه التقليدية ليست متاحة بسهولة في معظم المختبرات. للمختبرات دون الوصول إلى هذه الموارد، قدمنا ​​لاصقة تلفيق الشريط كوسيلة لخلق قوالب مع م?...

في هندسة الأنسجة وbiosensing، والقدرة على التحكم في التنظيم المكاني للبروتينات وخلايا على نطاق ميكرون، أصبحت ذات أهمية متزايدة على مدى العقود الأربعة الماضية 1، 2، 3. وقد سمح التنظيم المكاني دقيقة من البروتينات والخلايا الباحثين لدراسة التفاعل بين الخلايا وركائز التي تحتوي على أنواع مماثلة أو مختلفة من الخلايا، لتوجيه نمو الخلايا، ولشل حركة الجزيئات الحيوية لتصنيع أجهزة الاستشعار 4، 5، 6، 7، 8، 9. وتشمل الأساليب الحالية للبروتينات الزخرفة photopatterning وmicrocontact الطباعة. Photopatterning تستخدم المواد الحساسة للضوء التي crosslinked عند التعرض لغلاهالأشعة فوق البنفسجية (UV) الضوء. ضوء الأشعة فوق البنفسجية التي تستهدف الضوئية الرئيسية (التي تتكون من مناطق شفافة مع المناطق الداكنة لمنع الأشعة فوق البنفسجية نقل الضوء) يسبب يشابك في مناطق محددة والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لمرفق لاحق من المواد الحيوية أو خلايا 10 و 11. في حين أن هذا المخطط هو دقيق جدا ويسمح لمراقبة دقيقة من تضاريس سطح الثقافة، فإنه يقتصر على الجزيئات الحيوية حساسة للأشعة فوق البنفسجية التي يمكن نمط من الأشعة فوق البنفسجية (12). microcontact الطباعة هي طريقة شعبية أخرى من الزخرفة بروتينات معينة 13 و 14. في هذه الطريقة، يتم التعامل على siloxane (PDMS) ختم بولي ميثيل مع مجموعة متنوعة من الكواشف تعديل السطح قبل نقعه في حل الركيزة الجزيئية البيولوجية الذي تم اختياره. ثم يتم الضغط برفق على ساترة الزجاج أو أي سطح آخر وهكذا &quot;ختم&quot; جزيء حيوي على سطح الثقافة. هوويفر، يقتصر ختم لنوع من المواد التي يمكن نقلها وكذلك بلل من الجزيئات الحيوية لسطح PDMS ختم 15. الزخرفة مباشرة من الخلايا يمكن أن يكون أكثر صعوبة وتعتمد على أساليب معقدة مثل ركائز للتحويل، وأساليب الاستنسل مقرها، أو الزخرفة مع خلية التصاق جزيئات محددة 16 و 17. تقتصر هذه الأساليب في قدرتها على خلايا نمط نظرا لعدم وجود متوافقة ركائز التصاق الخلية، عدم توافق عملية للعمل مع الخلايا الحساسة البيولوجية والقيود، عدم الاتساق في استنساخ الزخرفة، وتعقيد الإجراءات. على سبيل المثال، مع ركائز للتحويل، تحتاج ركائز مخصصة لتكون مصممة لكل نوع من الخلايا، لتبديل تمسكهم أنواع معينة من الخلايا دون تدهور عند التعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية والحرارة المستخدمة في عملية 17 &lt;<html> الطبقة سوب = &quot;XREF&quot;&gt; 18، 19، 20. أساليب الزخرفة على أساس الاستنسل وتنوعا في قدرتها على خلايا النمط. ومع ذلك، فإنه من الصعب لتصنيع الإستنسل PDMS في سمك مناسبة للاستخدام 16، 21. الحقن المباشر للخلايا في القنوات ميكروفلويديك PDMS لها بعض المزايا مثل: 1) سهولة في تلفيق من القنوات ميكروفلويديك و2) ملاءمة لكثير من الخلايا وركائز مختلفة. ومع ذلك، فإن القضية السائدة من القبض على فقاعة الهواء أثناء عملية الحقن بسبب للا مائية من PDMS دون استخدام تنظيف البلازما، أو وسائل أخرى لتقليل فقاعات الهواء، ويجعل من الصعب خلق باستمرار خلايا نقوش على الزجاج أو البلاستيك السطوح 21. توسع هذا العمل على شعري micromolding 22، 23،معشوقة = &quot;XREF&quot;&gt; 24 و 25 و 26 و تقارير طريقة لحقن البروتين والخلايا تعليق في microchannels. الطريقة المستخدمة هنا يدل على الزخرفة من ركائز وكلا الزخرفة المباشرة وغير المباشرة لأنواع معينة من الخلايا. هذه التقنية يتغلب للا مائية عالية من PDMS ويلغي وجود فقاعات أثناء الحقن إما ركائز أو الخلايا عن طريق الاستفادة من نفاذية الغاز من PDMS 27. توضح هذه الورقة استخدام هذه التقنية مع العديد من ركائز مختلفة وأنواع الخلايا. كما يسلط الضوء على المادة في تصنيع قوالب الطباعة الحجرية الناعمة باستخدام ضوئيه التقليدية فضلا عن بسيطة ولاصقة منخفضة التكلفة طريقة الشريط المفيد في الموارد إعدادات محدودة 28، 29.

<table><tbody><tr><td>CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools</td><td>Corel Corporation, Canada</td><td>X4 Version 14.0.0.701</td><td>CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device</td></tr><tr><td>Laser Printer HP</td><td>Hewlett Packard, CA</td><td>1739629</td><td>Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique</td></tr><tr><td>Bel-Art Dessicator</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-594-16B</td><td>Used to degass the PDMS mixture</td></tr><tr><td>Adhesive Scotch Tape</td><td>3M Product, MN</td><td>Tape 600</td><td>Used to fabricate adhesive tape Master</td></tr><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning, MI</td><td>1064291</td><td>Casting polymer</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-772-23</td><td>Used to keep the mold to cast with PDMS</td></tr><tr><td>Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)</td><td>Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan</td><td>2976#11</td><td>Used to cut the PDMS</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Ted Pella, CA</td><td>5627-07</td><td>Used to handle the PDMS cast during peeling</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-546-2</td><td>Used as surface to pattern the Substrate</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-544-4</td><td>Used as surface to pattern the Substrate</td></tr><tr><td>Rubber Roller</td><td>Dick Blick Art Materials, IL</td><td>40104-1004</td><td>Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles</td></tr><tr><td>Laser Mask Writer</td><td>Heidelberg Instruments, Germany</td><td>DWL66fs</td><td>Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process</td></tr><tr><td>EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)</td><td>EV Group, Germany</td><td>EVG 620T(B)</td><td>Used to expose the photoresist to UV light</td></tr><tr><td>Spin Coater Headway</td><td>Headway Research Inc, TX</td><td>PWM32-PS-CB15PL</td><td>Used to spin coat the photoresist on silicon wafer</td></tr><tr><td>Photoresists SU-8 50</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y131269</td><td>Negative photoresist used for mold fabrication</td></tr><tr><td>SU-8 Devloper</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y020100</td><td>Photoresist developer</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane</td><td>UCT Specialties, PA</td><td>T2492-KG</td><td>Coat mold to avoid PDMS adhesion</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>190764</td><td>Cleaning Solvent</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>24102</td><td>Sterilization Solvent</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P0899-10MG</td><td>PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>L2020</td><td>Laminin aliquoted into 10 &amp;micro;L aliquots and diluted to 20 &amp;micro;g/&amp;micro;L in PBS prior to use</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>BP1605100</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>C2C12 Myoblast cell lline</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1722</td><td>Used to demonstrate C2C12 patterning</td></tr><tr><td>PC12 Cell Line</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1721</td><td>Used to demonstrate PC12 patterning</td></tr><tr><td>Collagen type 1, rat tail</td><td>BD Biosciences</td><td>40236</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, MA</td><td>11965-084</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Horse Serum, heat inactivated</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>26050-070</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P1951</td><td>To label cells</td></tr><tr><td>Calcein-AM live dead cell Assay kit</td><td>Invitrogen, MA</td><td>L-3224</td><td>Cell viability Assay</td></tr><tr><td>Biopsy Hole Punch</td><td>Ted Pella, CA</td><td>15110-10</td><td>Punched hole in PDMS</td></tr></tbody></table>

a versatile method of patterning proteins and cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

وتسمح هذه الطريقة في الزخرفة من البروتينات والزخرفة غير المباشرة من الخلايا باستخدام مسدود قنوات ميكروفلويديك مع أبعاد صغيرة مثل 10 ميكرون والتجهيزات المتوفرة في معظم المختبرات البيولوجية بمجرد اعتماد القالب الرئيسي. ويمكن استخدام هذه التقنية مع ...

Watch this Scientific Journal Video about A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells at JoVE.com

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

منهج تنوعا من الزخرفة البروتينات والخلايا

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

a-versatile-method-of-patterning-proteins-and-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.3K Views.  Rutgers University. This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Video: A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

الزخرفة من الخلايا الجذعية الجنينية باستخدام رقاقة بيو فليب

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Biology

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

خلية المشارك الثقافة الزخرفة باستخدام مائي مرحلتين أنظمة

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

الزخرفة الخلية على Photolithographically معرفة Parylene-C: شافي<sub&gt; 2</sub&gt; ركائز

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

الطبعة Microcontact من البروتينات لبيولوجيا الخلية

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

رسم خرائط التنظيم المكاني الناشئ للخلايا الثديية باستخدام الأنماط الدقيقة والتصوير الكمي

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Developmental Biology

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

إعداد Tunable خارج الخلية مصفوفة microenvironments لتقييم شوان الخلية الظاهري مواصفات

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

بسيطة، بأسعار معقولة، ونمط وحدات من الخلايا باستخدام الحمض النووي

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular compartments while circumventing complications arising from natural cell-to-cell variations. To standardize cell shape, cells are either confined in 3D molds or controlled for adhesive geometry through adhesive islands. However, traditional micropatterning techniques based on photolithography and deep UV etching heavily depend on clean rooms or specialized equipment. Here we present an infrared laser assisted micropatterning technique (microphotopatterning) modified from Doyle et al. that can be conveniently set up with commercially available imaging systems. In this protocol, we use a Nikon A1R MP+ imaging system to generate micropatterns with micron precision through an infrared (IR) laser that ablates preset regions on poly-vinyl alcohol coated coverslips. We employ a custom script to enable automated pattern fabrication with high efficiency and accuracy in systems not equipped with a hardware autofocus. We show that this IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol results in defined patterns to which cells attach exclusively and take on the desired shape. Furthermore, data from a large number of cells can be averaged due to the standardization of cell shape. Patterns generated with this protocol, combined with high resolution imaging and quantitative analysis, can be used for relatively high throughput screens to identify molecular players mediating the link between form and function.

The protocol presented here enables automated fabrication of micropatterns that standardizes cell shape to study cytoskeletal structures within mammalian cells. This user-friendly technique can be set up with commercially available imaging systems and does not require specialized equipment inaccessible to standard cell biology laboratories.

السيطرة على هندسة الخلية من خلال الأشعة تحت الحمراء الليزر بمساعدة Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

توليد النمط لمجهر الجر المجهري

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...