A influência de fatores microambientais no comportamento celular é frequentemente estudada usando plataformas in vitro supersimplificadas, que isolam pistas únicas. Nossa abordagem cria substratos de cultura celular que combinam várias dessas pistas. Essa abordagem é altamente versátil e permite um estudo sistemático usando uma grande variedade de materiais de cultura celular, padrões de orientação de contato, leituras celulares e proteínas.
O procedimento será demonstrado por dois candidatos ao PSE do nosso laboratório. CAS VAN DER PUTTEN, e MIRKO D'URSO First, criem um molde de vidro negativo usando uma técnica de direito direto a laser femtosegundo contendo todas as características de interesse. Em seguida, coloque cuidadosamente o molde de vidro negativo na parte inferior de uma placa de Petri e despeje o polimer pré-polimero de Polidimetilsiloxano em cima do molde de vidro negativo para cobri-lo completamente.
Coloque esta placa de Petri no desiccador de vácuo e inicie a bomba de vácuo. Uma vez alcançado um vácuo, espere 5 minutos para remover todas as bolhas presentes na interface entre a superfície do molde e o polimero pré-polimero de Polidimetimetilaxano. Cure o PDMS pré polímero durante a noite no forno a 65 graus Celsius.
Após a cura, use uma espátula para levantar as bordas do PDMS. Remova o novo chip PDMS positivo recém-curado do molde de vidro negativo, e se o chip PDMS positivo tende a grudar no molde de vidro negativo, adicione etanol ou água às bordas da marca durante o levantamento. Em seguida, coloque o chip de Polidimetilsiloxano positivo em um dessecante ao lado de um pequeno frasco com uma gota de agente de silanização, e deixe o chip sob vácuo durante a noite.
Despeje pdms pré polímero no molde PDMS negativo para produzir vários chips de cultura celular de espessura de 5 milímetros. Em seguida, remova as bolhas usando o desiccador e cure por três horas a 65 graus Celsius. Use uma lâmina de barbear para cortar o chip até o tamanho final e armazene os chips em temperatura ambiente Para a passivação do substrato usando pinças, coloque o chip na cesta do asher de plasma.
Em seguida, use plasma de oxigênio para ativar os grupos hidroxilas na superfície do chip e ventilar a câmara de ashing usando nitrogênio. Tire o chip da cesta e coloque-o em um pequeno recipiente de Polidimetilsiloxano. Agora, use uma pipeta pasteur para adicionar 500 microliters de Poli-L-lysine na parte superior do chip, para imergir completamente a superfície na solução e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, remova 450 microliters da Poly-L-lysine do chip de cultura celular com uma pipeta. Em seguida, enxágue o trice de superfície do chip com 500 microlitres de 0,1 amortecedor HEPES molar. Mantenha a qualidade final do padrão deixando um pequeno volume de líquido no chip polidimetilsiloxano, para evitar a secagem da amostra.
Pouco antes do uso, prepare 500 microliters de 50 mililículos por mililitro metileno glicosic solução de valeto clicosic cyanamidal em 0,1 montes molares tampão por chip de cultura celular e incubar a amostra nele por 60 minutos. Usando uma micro pipeta, remova 450 microliters da solução de valera clicosic glicósica de polietileno de metoxi. Lave a superfície do chip cinco vezes com PBS por tubulação dentro e fora.
Para remover todos os mPEG-SVA desvinculados. Coloque o slide de vidro com um marcador fluorescente no caminho óptico do microscópio. Mude para o modo fluorescente no microscópio e concentre cuidadosamente a imagem primo, garantindo que tanto o logotipo quanto o texto estejam em foco.
Clique ao lado para ver os dados de calibração e o padrão para terminar o procedimento de calibração. Anote a localização Z do estágio ao calibrar e use este local como referência mais tarde no protocolo. Depois de remover o slide de calibração do palco coloque um slide de vidro contendo uma gota do iniciador de fotos no palco e coloque o substrato de cultura celular PDMS de cabeça para baixo, na gotícula do iniciador fotográfico.
Certifique-se de que as características 3D na superfície do substrato de cultura celular encarem o slide de vidro e estejam totalmente submersas no iniciador fotográfico, para garantir a padronização adequada. Concentre-se na parte superior ou inferior das estruturas convexas ou côncavas, respectivamente, e concentre-se na área do chip no local certo, conforme descrito no manuscrito. Ajuste as configurações de padronização de acordo com o recurso e selecione uma dose de 1000 milijoules por mililitro.
Clique no botão play na parte inferior direita da tela para iniciar a padronização. Uma vez terminado, observe o padrão exibido em verde. Usando uma micro pipeta, adicione dois mililitros de PBS a um frasco de 20 microgramas de fibronectina rotulada por rhodamina, para obter uma concentração de 10 microgramas por mililitro.
Pipeta suavemente para evitar as aglomerações proteicas e proteger da luz. Usando uma micro pipeta, adicione de 200 a 500 microlitres da solução proteica ao chip de cultura celular. Ajuste o tempo e a temperatura da incubação dependendo da proteína escolhida e certifique-se de cobrir a amostra.
Remova a solução proteica e lave o chip cinco vezes com 500 microliters de PBS estéril. Certifique-se de pipeta o PBS para cima e para baixo várias vezes acima de todas as características relevantes do chip de cultura celular, para remover qualquer proteína não ligada. Uma vez que a suspensão do celular esteja preparada, remova o PBS e adicione 1 mililitro da suspensão celular ao chip.
Em seguida, incubar por 60 minutos a 37 graus Celsius. Verifique a adesão das células no chip de cultura celular padrão sob um microscópio de campo brilhante. Procure por morfologias de células alongadas no caso de padrões de linha.
E se as células começaram a aderir fora da área padronizada, remova-as, escoando o meio para cima e para baixo diretamente acima das células do substrato. Após a coloração, coloque a amostra manchada de cabeça para baixo em uma gota de PBS em um slide de vidro. Em seguida, dependendo do nível de detalhe necessário, faça pilhas Z com um objetivo adequado e espaçamento Z para garantir a aquisição adequada da imagem.
Crie uma renderização 3D da pilha Z com software de renderização 3D. Um poço côncavo foi padronizado usando absorção molecular induzida pela luz de proteínas e a projeção de intensidade máxima e visão ortogonal foram visualizadas. O perfil de intensidade mostrou alta resolução de padrão transições acentuadas entre áreas padronizadas e não padronizadas e intensidade proteica consistente.
A padronização usando o plano focal único, bem como o método de dois e três planos focais mostrou um alinhamento perfeito dos padrões em cima das características. Os semi cilindros côncavos, os semi cilindros convexos, a superfície da sela e o PID foram padronizados usando linhas ou círculos concêntricos de várias larguras. O efeito dentro do esqueleto dos queratócitos humanos é manchado usando foliden e visualizado.
Os fibroblastos dérmicos foram cultivados em um semi cilindro côncavo padronizado e visualizados. As células sentiram e aderiram ao substrato de cultura celular multi-cue e permaneceram viáveis ao longo do tempo, conforme visualizado por F-actin, Vinculin e Núcleos. Além disso, as células formaram aderências focais principalmente nas linhas de fibronectina.
Os fibroblastos dérmicos humanos cultivados em um cilindro côncavo padronizado na presença de fibronectina de rhodamina aderiram ao substrato multi-cue e mostraram uma resposta de alinhamento, de acordo com o padrão de orientação de contato. A resposta de alinhamento e a viabilidade celular são mantidas durante toda a duração da cultura. A coisa mais importante ao executar este protocolo é evitar que a superfície do chip de cultura celular seque.
O uso de diferentes materiais de substrato, revestimentos proteicos e tipos de células pode exigir otimização adicional. Fornecer múltiplas pistas ambientais em 3D pode abrir novas possibilidades para orientar a organização celular em tecidos de engenharia complexos.
