微环境因素对细胞行为的影响通常使用过度简化的体外平台进行研究，该平台隔离了单个线索。我们的方法创造了结合了多种这些线索的细胞培养基质。这种方法用途广泛，可以使用各种细胞培养材料、接触引导模式、细胞读数和蛋白质进行系统研究。
该程序将由我们实验室的两名PSE候选者演示。CAS VAN DER PUTTEN 和 MIRKO D'URSO 首先，使用飞秒激光直接右转技术创建一个负片玻璃模具，其中包含所有感兴趣的特征。然后，小心地将负片玻璃模具放在培养皿的底部，并将聚二甲基硅氧烷预聚物倒在负片玻璃模具的顶部以使其完全覆盖。
将此培养皿放入真空干燥器中并启动真空泵。达到真空后，等待 5 分钟以去除模具表面和聚二甲基硅氧烷预聚物之间界面上存在的所有气泡。将PDMS预聚合物在65摄氏度的烤箱中固化过夜。
固化后，使用刮刀提起PDMS的边缘。从负片玻璃模具中取出新固化的正PDMS芯片，如果正片PDMS芯片倾向于粘在负片玻璃模具上，则在提起时在印记边缘加入乙醇或水。然后，将阳性聚二甲基硅氧烷芯片放入带有硅烷化剂液滴的小瓶旁边的干燥器中，并将芯片置于真空下过夜。
将PDMS预聚物倒入负极PDMS模具中，以生产5毫米厚的多个细胞培养芯片。接下来，使用干燥器去除气泡，并在 65 摄氏度下固化三个小时。使用剃须刀片将芯片切割成最终尺寸，并将芯片储存在室温下 对于使用镊子进行基板钝化，将芯片放入等离子体 Asher 的篮子中。
然后，使用氧气等离子体激活芯片表面的羟基，并使用氮气排出灰化室。将芯片从篮子中取出，放入一个小的聚二甲基硅氧烷容器中。现在，使用巴斯德移液管在芯片顶部加入500微升聚-L-赖氨酸，使表面完全浸入溶液中，并在室温下孵育30分钟。
然后，用移液管从细胞培养芯片中取出450微升聚-L-赖氨酸。接下来，用 500 微升 0.1 摩尔 HEPES 缓冲液冲洗芯片表面。通过在聚二甲基硅氧烷芯片上留下少量液体来保持最终图案质量，以防止样品干燥。
在使用前，在每个细胞培养芯片的0.1摩尔堆缓冲液中制备500微升每毫升甲氧基聚乙烯糖氰胺戊酸酯溶液，并将样品在其中孵育60分钟。使用微量移液器，除去450微升甲氧基聚乙烯糖氰胺戊酸酯溶液。通过移入和移出，用PBS清洗芯片表面五次。
删除所有未绑定的 mPEG-SVA。将带有荧光荧光笔的载玻片放在显微镜的光路中。在显微镜上切换到荧光模式，并仔细聚焦原始图像，确保徽标和文本都清晰对焦。
单击下一步查看校准数据和模式以完成校准程序。校准时记下载物台的Z位置，并在稍后的实验方案中将此位置用作参考。从载物台上取下校准载玻片后，将含有光引发剂液滴的载玻片放在载物台上，并将PDMS细胞培养底物倒置在光引发剂液滴中。
确保细胞培养基材表面的3D特征面向载玻片，并完全浸没在光引发剂中，以确保正确的图案化。分别关注凸或凹结构的顶部或底部，并专注于手稿中描述的正确位置的芯片区域。根据特征调整图案设置，并选择每毫升 1000 毫焦耳的剂量。
单击屏幕右下角的播放按钮开始图案化。完成后，观察以绿色显示的图案。使用微量移液管，将两毫升PBS加入20微克标记的纤连蛋白罗丹明的小瓶中，以获得每毫升10微克的浓度。
轻轻移液以避免蛋白质团块并避光。使用微量移液器，将200至500微升蛋白质溶液加入细胞培养芯片中。根据所选蛋白质调整孵育时间和温度，并确保覆盖样品。
取出蛋白质溶液，用500微升无菌PBS洗涤芯片五次。确保在细胞培养芯片的所有相关特征上方多次上下移液PBS，以去除任何未结合的蛋白质。准备好细胞悬液后，取出PBS并向芯片中加入1毫升细胞悬液。
然后，在 60 摄氏度下孵育 37 分钟。在明场显微镜下检查细胞在图案细胞培养芯片上的粘附。在线条图案的情况下寻找细长的细胞形态。
如果细胞开始粘附在图案区域之外，则通过将培养基直接在基质上的细胞上方上下移液来去除这些细胞。染色后，将染色的样品倒置在载玻片上的PBS液滴中。然后，根据所需的细节水平，使Z堆栈具有合适的物镜和Z间距，以确保正确的图像采集。
使用 3D 渲染软件创建 Z 堆栈的 3D 渲染。利用光诱导蛋白质的分子吸收对凹坑进行图案化，并可视化最大强度投影和正交视图。强度曲线显示图案化和非图案化区域之间的高模式分辨率急剧过渡以及一致的蛋白质强度。
使用单焦平面以及两个和三个焦平面方法的图案化表明图案在特征顶部的完美对齐。凹形半圆柱体、凸形半圆柱体、鞍面和PID采用各种宽度的直线或同心圆进行图案化。使用叶子对人类角质细胞骨骼内部的影响进行染色并可视化。
将真皮成纤维细胞培养在带图案的凹形半圆柱体上并可视化。细胞感测并粘附在多提示细胞培养底物上，并随着时间的推移保持活力，如F-肌动蛋白，长春斑蛋白和细胞核所示。此外，细胞主要在纤连蛋白系上形成局灶性粘附。
根据接触引导模式，在罗丹明纤连蛋白存在下培养在图案凹形圆柱体上的人真皮成纤维细胞粘附在多提示底物上并显示出对齐响应。在整个培养过程中保持比对反应和细胞活力。执行此协议时最重要的是防止细胞培养芯片的表面变干。
使用不同的底物材料、蛋白质包衣和细胞类型可能需要额外的优化。在3D中提供多种环境线索可以为引导复杂工程组织中的细胞组织开辟新的可能性。
