L'influenza dei fattori microambientali sul comportamento cellulare è spesso studiata utilizzando piattaforme in vitro troppo semplificate, che isolano singoli segnali. Il nostro approccio crea substrati di coltura cellulare che combinano più di questi segnali. Questo approccio è altamente versatile e consente uno studio sistematico utilizzando un'ampia varietà di materiali di coltura cellulare, modelli di guida a contatto, letture cellulari e proteine.
La procedura sarà dimostrata da due candidati PSE del nostro laboratorio. CAS VAN DER PUTTEN e MIRKO D'URSO Per prima cosa, creare uno stampo di vetro negativo utilizzando una tecnica laser a destra diretta laser a femtosecondi contenente tutte le caratteristiche di interesse. Quindi, posizionare con attenzione lo stampo di vetro negativo sul fondo di una piastra di Petri e versare il prepolimero di polidimetilsilossano sopra lo stampo di vetro negativo per coprirlo completamente.
Posizionare questa capsula di Petri nell'essiccatore sottovuoto e avviare la pompa per vuoto. Una volta ottenuto il vuoto, attendere 5 minuti per rimuovere tutte le bolle presenti nell'interfaccia tra la superficie dello stampo e il prepolimero di polidimetilsilossano. Polimerizzare il prepolimero PDMS durante la notte in forno a 65 gradi Celsius.
Dopo la polimerizzazione, utilizzare una spatola per sollevare i bordi del PDMS. Rimuovere il chip PDMS positivo appena polimerizzato dallo stampo in vetro negativo e, se il chip PDMS positivo tende ad aderire allo stampo in vetro negativo, aggiungere etanolo o acqua ai bordi dell'impronta durante il sollevamento. Quindi, posizionare il chip di polidimetilsilossano positivo in un essiccatore accanto a una piccola fiala con una goccia di agente silanizzazione e lasciare il chip sotto vuoto durante la notte.
Versare il prepolimero PDMS nello stampo PDMS negativo per produrre più chip di coltura cellulare di 5 millimetri di spessore. Quindi, rimuovere le bolle usando l'essiccatore e polimerizzare per tre ore a 65 gradi Celsius. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare il chip alla dimensione finale e conservare i trucioli a temperatura ambiente Per la passivazione del substrato con una pinzetta, posizionare il chip nel cestello dell'Asher al plasma.
Quindi, utilizzare il plasma di ossigeno per attivare i gruppi ossidrilici sulla superficie del chip e sfiatare la camera di cenere usando azoto. Estrarre il chip dal cestello e metterlo in un piccolo contenitore di polidimetilsilossano. Ora, utilizzare una pipetta pasteur per aggiungere 500 microlitri di poli-L-lisina sulla parte superiore del chip, per immergere completamente la superficie nella soluzione e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, rimuovere 450 microlitri di poli-L-lisina dal chip di coltura cellulare con una pipetta. Quindi, sciacquare la superficie del truciolo con 500 microlitri di tampone HEPES da 0,1 molari. Mantenere la qualità del modello finale lasciando un piccolo volume di liquido sul chip di polidimetilsilossano, per evitare l'essiccazione del campione.
Appena prima dell'uso, preparare 500 microlitri di 50 milligrammi per millilitro di metossi polietilenglicosico cianamidale valerato in 0,1 cumuli molari tampone per chip di coltura cellulare e incubare il campione in esso per 60 minuti. Utilizzando una micro pipetta, rimuovere 450 microlitri della soluzione di metossipolietilenglicosico cianamidale valerato. Lavare la superficie del truciolo cinque volte con PBS mediante pipettaggio dentro e fuori.
Per rimuovere tutti gli mPEG-SVA non associati. Posizionare il vetrino con un evidenziatore fluorescente nel percorso ottico del microscopio. Passare alla modalità fluorescente sul microscopio e mettere a fuoco attentamente l'immagine primo, assicurandosi che sia il logo che il testo siano a fuoco.
Fare clic su Avanti per visualizzare i dati e il modello di calibrazione per completare la procedura di calibrazione. Annotare la posizione Z dello stage durante la calibrazione e utilizzare questa posizione come riferimento più avanti nel protocollo. Dopo aver rimosso il vetrino di calibrazione dal palco, posizionare un vetrino contenente una goccia del fotoiniziatore sul palco e posizionare il substrato di coltura cellulare PDMS capovolto, nella goccia dell'iniziatore di foto.
Assicurarsi che le caratteristiche 3D sulla superficie del substrato di coltura cellulare siano rivolte verso il vetrino e siano completamente immerse nell'iniziatore di foto, per garantire una corretta creazione di pattern. Concentrati rispettivamente sulla parte superiore o inferiore delle strutture convesse o concave e concentrati sull'area del chip nella giusta posizione come descritto nel manoscritto. Regolare le impostazioni di pattern in base alla feature e selezionare una dose di 1000 millijoule per millilitro.
Fare clic sul pulsante di riproduzione nella parte inferiore destra dello schermo per avviare la serie. Una volta terminato, osservare il motivo visualizzato in verde. Utilizzando una micro pipetta, aggiungere due millilitri di PBS a una fiala di 20 microgrammi di rodamina marcata fibronectina, per ottenere una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro.
Pipetta delicatamente per evitare i grumi proteici e proteggere dalla luce. Utilizzando una micro pipetta, aggiungere da 200 a 500 microlitri della soluzione proteica al chip di coltura cellulare. Regolare il tempo di incubazione e la temperatura a seconda della proteina scelta e assicurarsi di coprire il campione.
Rimuovere la soluzione proteica e lavare il chip cinque volte con 500 microlitri di PBS sterile. Assicurarsi di pipettare il PBS su e giù più volte sopra tutte le caratteristiche rilevanti del chip di coltura cellulare, per rimuovere qualsiasi proteina non legata. Una volta preparata la sospensione cellulare, rimuovere PBS e aggiungere 1 millilitro della sospensione cellulare al chip.
Quindi, incubarlo per 60 minuti a 37 gradi Celsius. Controllare l'adesione delle cellule sul chip di coltura cellulare modello sotto un microscopio a campo luminoso. Cerca morfologie cellulari allungate nel caso di modelli di linee.
E se le cellule hanno iniziato ad aderire al di fuori dell'area modellata, rimuoverle pipettando il mezzo su e giù direttamente sopra le cellule sul substrato. Dopo la colorazione, posizionare il campione colorato capovolto in una goccia di PBS su un vetrino. Quindi, a seconda del livello di dettaglio richiesto, crea stack Z con un obiettivo adatto e una spaziatura Z per garantire una corretta acquisizione dell'immagine.
Crea un rendering 3D dello stack Z con il software di rendering 3D. Una fossa concava è stata modellata utilizzando l'assorbimento molecolare indotto dalla luce delle proteine e sono state visualizzate la proiezione di massima intensità e la vista ortogonale. Il profilo di intensità ha mostrato transizioni nette ad alta risoluzione del pattern tra aree modellate e non modellate e intensità proteica costante.
La creazione di pattern utilizzando il singolo piano focale e il metodo a due e tre piani focali ha mostrato un perfetto allineamento dei modelli sopra le caratteristiche. I semicilindri concavi, i semicilindri convessi, la superficie della sella e il PID sono stati modellati utilizzando linee o cerchi concentrici di varie larghezze. L'effetto all'interno dello scheletro dei cheratociti umani viene colorato usando foliden e visualizzato.
I fibroblasti dermici sono stati coltivati su un semicilindro concavo modellato e visualizzati. Le cellule hanno percepito e aderito al substrato di coltura cellulare multi cue e sono rimaste vitali nel tempo come visualizzato da F-actina, Vinculin e Nuclei. Inoltre, le cellule formavano aderenze focali principalmente sulle linee di fibronectina.
I fibroblasti dermici umani coltivati su un cilindro concavo modellato in presenza di fibronectina rodamina hanno aderito al substrato multi cue e hanno mostrato una risposta di allineamento, secondo il modello di guida del contatto. La risposta di allineamento e la vitalità cellulare vengono mantenute per tutta la durata della coltura. La cosa più importante quando si esegue questo protocollo è impedire che la superficie del chip di coltura cellulare si secchi.
L'uso di diversi materiali di substrato, rivestimenti proteici e tipi di cellule potrebbe richiedere un'ulteriore ottimizzazione. Fornire molteplici segnali ambientali in 3D può aprire nuove possibilità per guidare l'organizzazione cellulare in tessuti ingegneristici complessi.
