إن عدم وجود علامات محددة للأنابيب النانوية النفقية يحد من التقدم في هذا المجال وهناك طلب متزايد على طريقة لتحديد وتوصيف وقياس الأنابيب النانوية النفقية. من الصعب تنفيذ طرق الكشف التلقائي بدون الخبرة اللازمة لتطوير خوارزمية و / أو تغيير الخوارزمية الحالية ، ولكن طريقتنا اليدوية سهلة التنفيذ بدقة أفضل. يتم تنفيذ النقل بعيد المدى بين الخلايا عبر الأنابيب النانوية النفقية بعدة طرق في نماذج الأمراض المختلفة ، بما في ذلك علم الأمراض التنكسية العصبية والانتشار الفيروسي والسرطان.
وبالتالي ، فإن الدراسات على الأنابيب النانوية النفقية لفهم دورها في التسبب في المرض مهمة. من الممكن أن تنكسر الأنابيب النانوية النفقية أثناء عملية التلطيخ. تجنب استخدام زلات الغطاء والتركيب على الشرائح ، باستخدام أطباق التصوير ذات القاع الزجاجي بدلا من ذلك.
يساعد بروتوكول التثبيت المعدل في الحفاظ على الأنابيب النانوية النفقية سليمة. سيوضح الإجراء ديباك كيه في ، طالب دكتوراه من مختبر سانجيتا ناف. للبدء ، اغسل الخلايا الضابطة والخلايا المعالجة بقليل القسيمات A-beta مرتين باستخدام PBS لمدة دقيقتين قبل التثبيت.
تحضير محلول كارنوفسكي المثبت باستخدام 2٪ مثبت فورمالين و 2.5٪ جلوتارالدهيد مذاب في محلول فوسفات مولاري 0.1 من الأس الهيدروجيني 7.2. ثم قم بإصلاح الخلايا في طبق التصوير عن طريق إضافة محلول Karnovsky المثبت لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تحضير المخزن المؤقت الحضانة عن طريق إذابة 0.1 غرام من الصابونين في خمسة ملليلتر من FBS وتخفيفه بإضافة 95 ملليلتر من PBS.
ثم اغسل الخلايا الثابتة مرتين باستخدام مخزن الحضانة لمدة دقيقتين. بعد التثبيت ، أضف أول جسم مضاد ضد phospho-PAK1 ، وأضف تخفيفا من واحد إلى 250 في مخزن الحضانة واحتضانه طوال الليل عند أربع درجات مئوية في غرفة مظلمة ورطبة. في اليوم التالي بعد 24 ساعة من الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن الحضانة لمدة دقيقتين.
ثم أضف الجسم المضاد الثانوي المترافق إلى Alexa Fluor 488 و Phalloidin 555. احتضان الخلايا في غرفة مظلمة رطبة لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام عازل الحضانة لمدة دقيقتين.
قم بتلطيخ النواة عن طريق إضافة DAPI في تخفيف واحد إلى 2000 واحتضانها لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تحضير وسط تركيب دابكو باستخدام 25 ملليغرام من دابكو في 90٪ جلسرين و 10٪ PBS. للذوبان بشكل صحيح ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 8.6 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المخفف من الدرجة الطيفية واحتفظ بالمحلول على هزاز للخلط.
كعامل مضاد للتبييض، أضف وسيط تركيب دابكو مباشرة إلى طبق التصوير الذي يحتوي على زلة الغطاء في الأسفل. انتظر لمدة ساعة إلى ساعتين على الأقل وتابع مباشرة إجراء التصوير البؤري. لتحديد الأنابيب النانوية النفقية ، التقط صور Z-stack للخلايا الملطخة بالمناعة باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر عن طريق تحديد القنوات أولا والنقر فوق أشعة الليزر المطلوبة بالتتابع في النوافذ المسار الأول والمسار الثاني والمسار الثالث في برنامج متحد البؤر.
انقر فوق الخيار TPMT أسفل نافذة المسار الأولى لالتقاط صور تباين التداخل التفاضلي مع قنوات التألق. حدد علامة التبويب الاستحواذ الخاصة بالبرنامج ، وانقر فوق علامة التبويب Z-stack ، وانتظر حتى تفتح نافذة. ثم انقر فوق Live Scan لتركيز الخلايا الموجودة أسفل الطبق.
حدد تلك الصورة المركزة كأول مكدس، ثم ركز لأعلى لرؤية الجزء العلوي من الخلية، وحدده كآخر مكدس. أوقف المسح المباشر وانقر فوق الرقم الموجود بجوار علامة التبويب الأمثل لإصلاح حجم خطوة المداخن التي تحدد عدد الشرائح والفواصل الزمنية بناء على سمك الخلايا. التقط صورا متسلسلة لثلاث قنوات من DAPI و FITC و TRITC باستخدام ليزر 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر والتقطها بوقت سكون بكسل يبلغ 1.02 ميكروثانية.
التقط الصور في قناة DIC باستخدام قنوات مضان لمراقبة حدود الخلية. افتح الصور البؤرية المحفوظة بتنسيق بيانات czi في برنامج فيجي للتحليل. حدد خيار Hyperstack لرؤية كل مكدس Z وقناة الصورة.
قم بتمرير القناة وأشرطة تمرير Z-stack لتحديد المكدس الدقيق لقناة معينة ذات أهمية. ثم حدد القناة الملطخة ب F-actin أولا عن طريق التمرير على شريط القناة والتمرير يدويا على Z-stacks لرؤية كل مكدس واحدا تلو الآخر. حدد الهياكل الملطخة ب F-actin التي يبدو أنها تربط الخلايا المرئية في الأجزاء السفلية من مداخن Z والقريبة من سطح طبق التصوير مع Z يساوي اثنين كعصبيين.
حدد الأنابيب النانوية النفقية ، خلية F-actin الإيجابية التي تحوم إلى قنوات الخلية عن طريق تمرير مداخن Z نحو الأعلى من Z يساوي أربعة. ابحث عن الخلايا العصبية بالقرب من الأجزاء السفلية من مداخن Z باتجاه السطح ولاحظ أنها تبدأ في الاختفاء مع تمرير مداخن Z نحو الأعلى عند Z يساوي ستة. تحديد الأنابيب النانوية النفقية الإيجابية phospho-PAK1 بشكل مشابه للأنابيب النانوية النفقية النفقية الإيجابية F-actin من خلال تحليل طبيعة تحوم القنوات من مداخن Z.
نظرا لأن تلطيخ الفوسفو-PAK1 أضعف من تلطيخ F-actin ، فابحث عن الأنابيب النانوية النفقية الملطخة بالفوسفو-PAK1 عند Z تساوي أربعة وعند Z تساوي ستة. علاوة على ذلك ، راقب صور DIC للتحقق من أن هياكل الأنابيب النانوية النفقية الملطخة بالفوسفات F-actin و phospho-PAK1 هي قنوات غشائية بين الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، قم بدمج قنوات F-actin و phospho-PAK1 للتحقق من أن الأنابيب النانوية النفقية المحددة هي هياكل ملطخة بالمشاركة F-actin و phospho-PAK1.
لتحديد كمية الأنابيب النانوية النفقية ، قم بحساب إجمالي أرقام الخلايا والأنابيب النانوية النفقية المحددة يدويا وتمثيل الأرقام كنسب مئوية. للتمييز بين الأنابيب النانوية النفقية الأنبوبية الإيجابية F-actin و beta III مثل القنوات التي تحوم من صور Z-stack ، قم بدمج قنوات F-actin و beta III tubulin ، ثم قم بتحليل مداخن Z للصور المدمجة. ابحث عن الأنابيب النانوية النفقية الملطخة ب F-actin حصريا والتي يمكن رؤيتها بشكل خافت عند Z تساوي ثلاثة وبارزة عند Z تساوي ستة و Z تساوي تسعة.
وبالمثل ، حدد F-actin و beta III tubulin. الأنابيب النانوية النفقية المزدوجة الإيجابية مثل قنوات التحليق عند Z تساوي ستة و Z تساوي تسعة. حدد نتوءات أخرى غير ملطخة بالفوبولين F-actin و beta III من الأجزاء السفلية من مداخن Z.
قم بقياس قطر الأنابيب النانوية النفقية باستخدام أداة Line في فيجي. تحقق من مقياس القياس بالنقر فوق تحليل ثم قم بتعيين المقياس بحيث يتم تعيين المسافة بالبكسل تلقائيا من صور czi. قم بقياس أقطار الأنابيب النانوية النفقية في المستوى XY.
باستخدام المكون الإضافي Volume Viewer في فيجي والذي يسمح بإعادة التقطيع ثلاثي الأبعاد والتصور ثلاثي الأبعاد الممكن للعتبة ، قم بتقسيم صور Z-stack إلى قنوات فردية. ثم قم بقص صور Z-stack أحادية القناة لاستخدام عرض إعادة الإعمار 3D لتسليط الضوء على واحد أو اثنين من الأنابيب النانوية النفقية أو الخلايا العصبية في وقت واحد. قم بتثبيت أنابيب نانوية نفقية واحدة أو عصبية في المستوى XY وحدد المقاطع العرضية للوصول XZ و YZ.
راقب الخلايا العصبية في الجزء السفلي من المستوى XZ ، في المستويين XZ و YZ ، والأنابيب النانوية النفقية في مداخن Z العلوية. حدد الأنابيب النانوية النفقية الفردية أو neurite لإعادة بناء عرض حجم 3D في المستوى XZ. في إعادة البناء 3D ، لاحظ الخلايا العصبية في الجزء السفلي من المستوى Z والأنابيب النانوية النفقية التي تظهر كهياكل تحوم تربط خليتين دون لمس المستوى Z السفلي.
تم تحليل صور Z-stack متحدة البؤر للخلايا المناعية مع F-actin و phospho-PAK1 لتحديد الأنابيب النانوية النفقية. علاوة على ذلك ، تم تحليل صور DIC للتحقق من أن هياكل الأنابيب النانوية النفقية الملطخة ب F-actin و phospho-PAK1 كانت قنوات غشائية بين الخلايا. كانت الخلايا ملطخة بمناعة مزدوجة مع توبولين F-actin و beta III وتم تمييز قنوات الغشاء الإيجابي المزدوج F-actin الأنبوبية الأنبوبية الأنبوبية الأنبوبية الإيجابية.
تم تمييز الأنابيب النانوية النفقية المعبر عنها بالاشتراك مع phospho-PAK1 و F-actin عن نتوءات الخلايا العصبية الأخرى من خلال بناء صور عرض حجم 3D بناء على خصائصها المتمثلة في التحليق بين خليتين دون لمس الطبقة التحتية. يعد استخدام العامل المثبت الأيمن أمرا مهما لأن التثبيت غير الكامل للعينة قد يؤدي إلى تدهور سريع للبروتين للبروتينات المستهدفة وتقليل النشاط المناعي المحدد.
