Der Mangel an tunnelnden Nanoröhren-spezifischen Markern schränkt den Fortschritt auf diesem Gebiet ein und es besteht eine zunehmende Nachfrage nach einer Methode zur Identifizierung, Charakterisierung und Quantifizierung von Tunnelnanoröhren. Automatische Erkennungsmethoden sind ohne das Know-how, einen Algorithmus zu entwickeln und / oder den bestehenden Algorithmus zu ändern, schwierig zu implementieren, aber unsere manuelle Methode ist einfach und präziser zu implementieren. Der interzelluläre Langstreckentransfer über tunnelnde Nanoröhrchen wird auf verschiedene Arten in verschiedenen Krankheitsmodellen implementiert, darunter neurodegenerative Pathologie, virale Ausbreitung und Krebs.
Daher sind Studien zum Tunneln von Nanoröhren wichtig, um ihre Rolle in der Pathogenese zu verstehen. Es ist möglich, dass die tunnelnden Nanoröhren während des Färbevorgangs brechen. Vermeiden Sie die Verwendung von Abdeckscheiben und die Montage auf den Objektträgern, sondern verwenden Sie stattdessen Glasbodenschalen.
Ein modifiziertes Fixierungsprotokoll hilft, Nanoröhren intakt zu halten. Deepak KV, Doktorand aus dem Labor von Sangeeta NAF, demonstriert das Verfahren. Um zu beginnen, waschen Sie die Kontroll- und oligomeren A-beta-behandelten Zellen zweimal mit PBS für zwei Minuten vor der Fixierung.
Die Fixierlösung von Karnovsky wird unter Verwendung von 2% Formalinfixiermittel und 2,5% Glutaraldehyd, gelöst in 0,1 molaren Phosphatpuffer von pH 7,2, hergestellt. Dann fixieren Sie die Zellen in der Bildgebungsschale, indem Sie Karnovskys Fixierlösung für 45 Minuten bei Raumtemperatur hinzufügen. Bereiten Sie den Inkubationspuffer vor, indem Sie 0,1 Gramm Saponin in fünf Milliliter FBS auflösen und durch Zugabe von 95 Milliliter PBS verdünnen.
Dann waschen Sie die fixierten Zellen zweimal mit Inkubationspuffer für zwei Minuten. Nach der Fixierung den ersten Antikörper gegen Phospho-PAK1 zugeben, eine Verdünnung von eins auf 250 in den Inkubationspuffer geben und über Nacht bei vier Grad Celsius in einer dunklen, feuchten Kammer inkubieren. Am nächsten Tag nach 24 Stunden Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit dem Inkubationspuffer für zwei Minuten.
Fügen Sie dann sekundäre Antikörper hinzu, die an Alexa Fluor 488 und Phalloidin 555 konjugiert sind. Inkubieren Sie die Zellen in der dunklen, feuchten Kammer für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit Inkubationspuffer für zwei Minuten.
Färben Sie den Kern, indem Sie DAPI in einer Verdünnung von eins bis 2000 hinzufügen und fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Bereiten Sie das DABCO-Montagemedium mit 25 Milligramm DABCO in 90 % Glycerin und 10 % PBS vor. Um sich richtig aufzulösen, stellen Sie den pH-Wert mit spektrophotometrischer verdünnter Salzsäure auf 8,6 ein und halten Sie die Lösung zum Mischen auf einer Wippe.
Als Anti-Bleichmittel geben Sie das DABCO-Montagemedium direkt auf die Bildschale mit dem Abdeckglas an der Unterseite. Warten Sie mindestens ein bis zwei Stunden und fahren Sie direkt mit der konfokalen Bildgebung fort. Um tunnelnde Nanoröhren zu identifizieren, erfassen Sie Z-Stack-Bilder von immungefärbten Zellen mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop, indem Sie zuerst die Kanäle auswählen und die erforderlichen Laser nacheinander in die Fenster Spur eins, Spur zwei und Spur drei in der konfokalen Software klicken.
Klicken Sie auf die Option TPMT unter dem Track-One-Fenster, um die differentiellen Interferenzkontrastbilder mit Fluoreszenzkanälen aufzunehmen. Wählen Sie die Registerkarte Akquisition der Software, klicken Sie auf die Registerkarte Z-Stack und warten Sie, bis sich ein Fenster öffnet. Klicken Sie dann auf Live Scan, um die Zellen am unteren Rand der Schale zu fokussieren.
Wählen Sie dieses fokussierte Bild als ersten Stapel aus, und fokussieren Sie sich dann, um den obersten Teil der Zelle zu sehen, und wählen Sie diesen als letzten Stapel aus. Stoppen Sie den Live-Scan und klicken Sie auf die Zahl neben der Registerkarte Optimal, um die Schrittweite der Stapel festzulegen, die die Anzahl der Slices und die Intervalle basierend auf der Dicke der Zellen bestimmt. Nehmen Sie sequenzielle Bilder von drei Kanälen von DAPI, FITC und TRITC mit 405-Nanometer-, 488-Nanometer- und 561-Nanometer-Lasern auf und erfassen Sie sie mit einer Pixelverweilzeit von 1,02 Mikrosekunden.
Nehmen Sie Bilder im DIC-Kanal mit Fluoreszenzkanälen auf, um die Zellgrenze zu beobachten. Öffnen Sie die im czi-Datenformat gespeicherten konfokalen Bilder in der Fidschi-Software zur Analyse. Wählen Sie die Option Hyperstack, um jeden Z-Stack und Kanal des Bildes anzuzeigen.
Scrollen Sie durch den Kanal und die Z-Stack-Bildlaufleisten, um den genauen Stapel eines bestimmten Kanals von Interesse auszuwählen. Wählen Sie dann zuerst den F-Aktin-gefärbten Kanal aus, indem Sie die Kanalleiste scrollen und manuell die Z-Stapel scrollen, um jeden Stapel einzeln zu sehen. Identifizieren Sie die F-Aktin-gefärbten Strukturen, die Zellen zu verbinden scheinen, die in den unteren Teilen der Z-Stapel sichtbar sind und sich nahe der Oberfläche der Bildgebungsschale befinden, wobei Z gleich zwei als Neuriten ist.
Identifizieren Sie die tunnelnden Nanoröhren, die F-Aktin-positiven schwebenden Zell-zu-Zell-Leitungen, indem Sie die Z-Stapel von Z gleich bis vier nach oben scrollen. Suchen Sie nach Neuriten in der Nähe der unteren Teile der Z-Stapel zur Oberfläche hin und beobachten Sie, dass sie mit dem Scrollen von Z-Stapeln nach oben bei Z gleich sechs zu verschwinden beginnen. Identifizieren Sie Phospho-PAK1-positive Tunnelnanoröhren ähnlich wie F-Aktin-positive Tunnelnanoröhren, indem Sie die schwebende Natur der Leitungen aus den Z-Stacks analysieren.
Da die Phospho-PAK1-Färbung schwächer ist als die F-Aktin-Färbung, suchen Sie nach Phospho-PAK1-gefärbten Tunnelnanoröhren bei Z gleich vier und bei Z gleich sechs. Beobachten Sie außerdem die DIC-Bilder, um zu überprüfen, ob die F-Aktin- und Phospho-PAK1-gefärbten Tunnel-Nanoröhrenstrukturen Membrankanäle zwischen Zellen sind. Darüber hinaus verschmelzen F-Aktin- und Phospho-PAK1-Kanäle, um zu überprüfen, ob die identifizierten Tunnelnanoröhren F-Aktin- und Phospho-PAK1-co-gefärbte Strukturen sind.
Um die tunnelnden Nanoröhren zu quantifizieren, zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen und die identifizierten Tunnelnanoröhren manuell und stellen Sie die Zahlen als Prozentsätze dar. Um F-Aktin- und Beta-III-Tubulin-positive Tunnel-Nanoröhren wie schwebende Leitungen von Z-Stack-Bildern zu unterscheiden, verschmelzen Sie F-Aktin- und Beta-III-Tubulinkanäle und analysieren Sie dann die Z-Stapel der zusammengeführten Bilder. Suchen Sie nach ausschließlich F-Aktin-gefärbten Tunnel-Nanoröhren, die bei Z gleich drei schwach sichtbar und bei Z gleich sechs und Z gleich neun prominent sind.
In ähnlicher Weise identifizieren Sie F-Aktin und Beta-III-Tubulin. doppelt positive tunnelnde Nanoröhren wie schwebende Leitungen bei Z gleich sechs und Z gleich neun. Identifizieren Sie andere F-Aktin- und Beta-III-Tubulin-gefärbte, nicht schwebende Vorsprünge aus den unteren Teilen der Z-Stacks.
Messen Sie den Durchmesser der Tunnel-Nanoröhren mit dem Line-Tool in Fidschi. Überprüfen Sie die Maßskala, indem Sie auf Analysieren klicken, und legen Sie dann den Maßstab so fest, dass der Abstand in Pixel automatisch aus den czi-Bildern festgelegt wird. Messen Sie die Durchmesser der tunnelnden Nanoröhren in der XY-Ebene.
Mit dem Volume Viewer-Plugin in Fidschi, das 3D-Re-Slicing und Schwellenwert-fähige 3D-Visualisierung ermöglicht, teilen Sie die Z-Stack-Bilder in einzelne Kanäle auf. Schneiden Sie dann die Einkanal-Z-Stack-Bilder zu, um die 3D-Rekonstruktionsansicht zu verwenden, um ein oder zwei tunnelnde Nanoröhren oder Neuriten gleichzeitig hervorzuheben. Stecken Sie eine einzelne tunnelnde Nanoröhre oder ein Neurit in die XY-Ebene und markieren Sie XZ- und YZ-Zugangsquerschnitte.
Beobachten Sie die Neuriten am unteren Rand der XZ-Ebene, in der XZ- und YZ-Ebene und die tunnelnden Nanoröhren in den oberen Z-Stacks. Wählen Sie die einzelnen tunnelnden Nanoröhren oder Neuriten aus, um die 3D-Volumenansicht in der XZ-Ebene zu rekonstruieren. In der 3D-Rekonstruktion beobachten Sie die Neuriten am unteren Rand der Z-Ebene und die tunnelnden Nanoröhren, die als schwebende Strukturen erscheinen, die zwei Zellen verbinden, ohne die untere Z-Ebene zu berühren.
Konfokale Z-Stack-Bilder von immungefärbten Zellen mit F-Aktin und Phospho-PAK1 wurden analysiert, um tunnelnde Nanoröhren zu identifizieren. Darüber hinaus wurden DIC-Bilder analysiert, um zu bestätigen, dass die F-Aktin- und Phospho-PAK1-gefärbten Tunnel-Nanoröhrenstrukturen Membrankanäle zwischen Zellen waren. Die Zellen wurden doppelt mit F-Aktin und Beta-III-Tubulin immungefärbt und die tunnelnden nanoröhrenartigen F-Aktin- und Beta-III-Tubulin-Doppelpositivmembranleitungen wurden nur von F-Aktin-positiven Tunnel-Nanoröhren unterschieden.
Die tunnelnden Nanoröhren, die zusammen mit Phospho-PAK1 und F-Aktin exprimiert wurden, wurden von den Zellvorsprüngen anderer Neuriten unterschieden, indem sie 3D-Volumenansichtsbilder basierend auf ihrer Eigenschaft konstruierten, zwischen zwei Zellen zu schweben, ohne das Substrat zu berühren. Die Verwendung des richtigen Fixiermittels ist wichtig, da eine unvollkommene Fixierung der Probe zu einem schnellen proteolytischen Abbau der Zielproteine und einer Verringerung der spezifischen Immunreaktivität führen kann.
