המחסור בסמנים ספציפיים של ננו-צינוריות מנהור מגביל את ההתקדמות בתחום ויש דרישה גוברת לשיטה לזיהוי, אפיון וכימות של ננו-צינוריות מנהור. שיטות זיהוי אוטומטיות קשות ליישום ללא המומחיות לפתח אלגוריתם ו/או לשנות את האלגוריתם הקיים, אך השיטה הידנית שלנו קלה ליישום בדיוק רב יותר. העברה בין-תאית ארוכת טווח באמצעות ננו-צינוריות מנהור מיושמת במספר דרכים במודלים שונים של מחלות, כולל פתולוגיה נוירודגנרטיבית, התפשטות נגיפית וסרטן.
לכן, מחקרים על מנהור ננו-צינוריות כדי להבין את תפקידם בפתוגנזה הם חשובים. ייתכן שננו-צינוריות המנהור עלולות להישבר במהלך תהליך הצביעה. הימנע משימוש בכיסויי כיסוי ובהרכבה על השקופיות, והשתמש במקום זאת בכלי הדמיה עם תחתית זכוכית.
פרוטוקול קיבוע שונה מסייע לשמור על ננו-צינוריות מנהור שלמות. מי שידגים את ההליך יהיה דיפאק KV, דוקטורנט מהמעבדה של סנג'יטה NAF. כדי להתחיל, יש לשטוף את תאי הבקרה וה-A-beta האוליגומריים פעמיים עם PBS במשך שתי דקות לפני הקיבוע.
הכן את הפתרון המקבע של קרנובסקי באמצעות 2% פורמלין מקובע ו-2.5% גלוטרלדהיד מומס בחיץ פוספט טוחן 0.1 של pH 7.2. לאחר מכן תקן את התאים בצלחת ההדמיה על ידי הוספת הפתרון המקבע של קרנובסקי למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. הכן את מאגר הדגירה על ידי המסת 0.1 גרם של saponin בחמישה מיליליטר של FBS ומדולל על ידי הוספת 95 מיליליטר של PBS.
לאחר מכן לשטוף את התאים הקבועים פעמיים באמצעות מאגר הדגירה במשך שתי דקות. לאחר הקיבוע, מוסיפים את הנוגדן הראשון נגד phospho-PAK1, מוסיפים דילול של אחד עד 250 במאגר הדגירה ודוגרים לילה בארבע מעלות צלזיוס בתא חשוך ולח. למחרת לאחר 24 שעות של דגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ הדגירה במשך שתי דקות.
לאחר מכן הוסיפו נוגדן משני המצומד לאלקסה פלואור 488 ופלוידין 555. לדגור על התאים בתא החשוך והלח למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם מאגר הדגירה במשך שתי דקות.
הכתימו את הגרעין על ידי הוספת DAPI בדילול של אחד עד 2000 ודגירה במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הכן מדיום הרכבה של DABCO באמצעות 25 מיליגרם של DABCO ב-90% גליצרול ו-10% PBS. כדי להתמוסס כראוי, התאם את ה- pH ל- 8.6 באמצעות חומצה הידרוכלורית מדוללת בדרגה ספקטרופוטומטרית ושמור את התמיסה על נדנדה לערבוב.
כחומר נגד הלבנה, הוסיפו את מדיום ההרכבה של DABCO ישירות על צלחת ההדמיה המכילה את החלקת הכיסוי בתחתית. המתן לפחות שעה עד שעתיים והמשך ישירות לביצוע הדמיה קונפוקלית. כדי לזהות ננו-צינוריות מנהור, צלם תמונות Z-stack של תאים מדוכאי חיסון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר על ידי בחירה ראשונה של התעלות ולחיצה על הלייזרים הנדרשים ברצף בחלונות עקוב אחר אחד, עקוב אחר שתיים ועקוב אחר שלוש בתוכנת הקונפוקל.
לחץ על האפשרות TPMT מתחת לחלון רצועה אחד כדי לצלם את תמונות הניגודיות של הפרעות דיפרנציאליות עם ערוצי פלואורסצנציה. בחר בכרטיסייה רכישה של התוכנה, לחץ על הכרטיסייה Z-stack והמתן לפתיחת חלון. לאחר מכן לחצו על 'סריקה חיה' כדי למקד את התאים בתחתית המנה.
בחר תמונה ממוקדת זו כאוסף הראשון, ולאחר מכן התמקד למעלה כדי לראות את החלק העליון ביותר של התא, ובחר בה כאוסף האחרון. הפסק את הסריקה החיה ולחץ על המספר שליד הכרטיסיה אופטימלי כדי לתקן את גודל הצעד של הערימות שקובע את מספר הפרוסות ואת המרווחים בהתבסס על עובי התאים. צלם תמונות עוקבות של שלושה ערוצים של DAPI, FITC ו- TRITC עם לייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו- 561 ננומטר, ולכוד עם זמן השהייה בפיקסלים של 1.02 מיקרו-שניות.
צלם תמונות בערוץ DIC עם ערוצים פלואורסצנטיים כדי לבחון את גבול התא. פתח את התמונות הקונפוקליות שנשמרו בפורמט נתונים czi בתוכנת פיג'י לניתוח. בחרו באפשרות Hyperstack כדי לראות כל ערימת Z וערוץ של התמונה.
גלול בפסי הגלילה של הערוץ ושל Z-stack כדי לבחור את הערימה המדויקת של ערוץ מסוים שמעניין אותך. לאחר מכן בחר תחילה את הערוץ המוכתם F-actin על-ידי גלילת סרגל הערוצים וגלילה ידנית של ערימות Z כדי לראות כל ערימה בזו אחר זו. זהה את המבנים המוכתמים ב-F-actin שנראים כמחברים תאים הנראים בחלקים התחתונים של ערימות ה-Z וקרובים לפני השטח של צלחת ההדמיה כאשר Z שווה לשניים כ-neurites.
זהה את הננו-צינוריות של המנהור, התא המרחף החיובי של F-actin לתעלות התא על ידי גלילת ערימות Z לכיוון החלק העליון מ-Z שווה לארבע. חפשו נוריטים ליד החלקים התחתונים של ערימות Z לכיוון פני השטח ושימו לב שהם מתחילים להיעלם עם גלילה של ערימות Z לכיוון החלק העליון ב-Z השווה לשש. זהה ננו-צינוריות מנהור חיוביות של phospho-PAK1 בדומה לננו-צינוריות מנהור חיוביות של F-actin על-ידי ניתוח האופי המרחף של הצינורות מערימות Z.
מכיוון שצביעת phospho-PAK1 חלשה יותר מכתמת F-actin, חפשו ננו-צינוריות מנהור מוכתמות ב-Z השווה לארבע וב-Z שווה לשישה. יתר על כן, התבונן בתמונות DIC כדי לוודא שמבני הננו-צינוריות המוכתמים F-actin ו- phospho-PAK1 הם צינורות ממברנה בין התאים. בנוסף, מזגו תעלות F-אקטין ו-phospho-PAK1 כדי לוודא שננו-צינוריות המנהור שזוהו הן מבנים מוכתמים במשותף של F-actin ו-phospho-PAK1.
כדי לכמת את הננו-צינוריות של המנהור, ספרו את סך כל מספרי התאים ואת הננו-צינוריות המזוהות של המנהור באופן ידני וייצגו את המספרים כאחוזים. כדי להבחין בין ננו-צינוריות מנהור חיוביות של F-actin ו-beta III tubulin, כגון צינורות מרחפים מתמונות Z-stack, מזגו את ערוצי הטובולין F-actin ו-beta III, ולאחר מכן נתחו את ערימות ה-Z של התמונות הממוזגות. חפשו אך ורק ננו-צינוריות מנהור מוכתמות ב-F-actin שנראות קלושות ב-Z שווה לשלוש ובולטות ב-Z שוות לשש ו-Z שווה לתשע.
באופן דומה, זהה F-אקטין ובטא III טובולין. ננו-צינוריות מנהור חיוביות כפולות כמו צינורות מרחפים ב-Z שווים לשש ו-Z שווה לתשע. זהה בליטות אחרות של F-actin ובטא III טובולין מוכתמות שאינן מרחפות מהחלקים התחתונים של ערימות Z.
מדוד את הקוטר של ננו-צינוריות המנהור באמצעות הכלי קו בפיג'י. אמת את קנה המידה על-ידי לחיצה על נתח ולאחר מכן הגדר קנה מידה כך שהמרחק בפיקסלים ייקבע אוטומטית מתמונות czi. מדוד את הקטרים של ננו-צינוריות המנהור במישור XY.
באמצעות תוסף Volume Viewer בפיג'י המאפשר חיתוך מחדש בתלת-ממד והדמיה תלת-ממדית התומכת בסף, פצל את תמונות Z-stack לערוצים בודדים. לאחר מכן חתוך את תמונות Z-stack של ערוץ יחיד כדי להשתמש בתצוגת שחזור תלת-ממדית כדי להדגיש ננו-צינוריות או נוריטים של מנהור אחד או שניים בכל פעם. הצמד ננו-צינוריות מנהור בודדות או נויריט במישור XY וסמן חתכי גישה XZ ו- YZ.
שימו לב לנויריטים בתחתית מישור XZ, במישורי XZ ו-YZ, ולננו-צינוריות המנהור בערימות Z העליונות. בחר את ננו-צינוריות המנהור הבודדות או את הנויריט כדי לשחזר את תצוגת הנפח התלת-ממדית במישור XZ. בשחזור התלת-ממדי, התבוננו בנויריטים בתחתית מישור ה-Z ובננו-צינוריות המנהור המופיעות כמבנים מרחפים המחברים בין שני תאים מבלי לגעת במישור ה-Z התחתון.
תמונות Z-stack קונפוקליות של תאים מדוכאי חיסון עם F-אקטין ופוספו-PAK1 נותחו כדי לזהות ננו-צינוריות מנהור. יתר על כן, תמונות DIC נותחו כדי לוודא שמבני הננו-צינוריות המוכתמות F-actin ו-phospho-PAK1 היו צינורות ממברנה בין תאים. התאים היו מדוכאי חיסון עם F-אקטין ובטא III טובולין, ותעלות הממברנה דמויי הננו-צינורית F-אקטין ובטא III טובולין דמויי ננו-צינוריות המנהור נבדלו מננו-צינוריות מנהור חיוביות בלבד של F-actin.
ננו-צינוריות המנהור המבוטאות יחד עם phospho-PAK1 ו-F-actin נבדלו מבליטות תאים של נוריטים אחרים על ידי בניית תמונות תצוגת נפח תלת-ממדיות בהתבסס על המאפיין שלהן של ריחוף בין שני תאים מבלי לגעת בתת-הסטרטום. שימוש בחומר מקבע נכון חשוב מכיוון שקיבוע לא מושלם של הדגימה עלול להוביל לפירוק פרוטאוליטי מהיר של חלבוני המטרה ולהפחתה בפעילות החיסונית הספציפית.
