Отсутствие специфических маркеров туннельных нанотрубок ограничивает прогресс в этой области, и существует растущий спрос на метод идентификации, характеристики и количественной оценки туннельных нанотрубок. Автоматические методы обнаружения трудно реализовать без опыта разработки алгоритма и / или изменения существующего алгоритма, но наш ручной метод легко реализовать с большей точностью. Дальний межклеточный перенос через туннельные нанотрубки реализуется несколькими способами в различных моделях заболеваний, включая нейродегенеративную патологию, распространение вируса и рак.
Таким образом, исследования на туннельных нанотрубках, чтобы понять их роль в патогенезе, важны. Возможно, туннельные нанотрубки могут сломаться во время процесса окрашивания. Избегайте использования скольжения крышки и крепления на слайдах, используя вместо этого стеклянные нижние тарелки для визуализации.
Модифицированный протокол фиксации помогает сохранить туннельные нанотрубки нетронутыми. Продемонстрировать процедуру будет Дипак КВ, аспирант из лаборатории Sangeeta NAF. Для начала промыть контрольные и олигомерные клетки, обработанные А-бета, дважды PBS в течение двух минут перед фиксацией.
Готовят фиксаторный раствор Карновского, используя 2%-ной формалиновый фиксатор и 2,5%-ный глутаральный альдегид, растворенный в 0,1-молярно-фосфатном буфере рН 7,2. Затем зафиксируйте клетки в тарелке для визуализации, добавив фиксирующий раствор Карновского в течение 45 минут при комнатной температуре. Готовят инкубационный буфер, растворяя 0,1 грамма сапонина в пяти миллилитрах FBS и разбавляя добавлением 95 миллилитров PBS.
Затем дважды промыть неподвижные клетки с помощью инкубационного буфера в течение двух минут. После фиксации добавляют первое антитело против фосфо-ПАК1, добавляют разведение от одного до 250 в инкубационный буфер и инкубируют на ночь при четырех градусах Цельсия в темной, влажной камере. На следующий день после 24 часов инкубации промыть клетки дважды инкубационным буфером в течение двух минут.
Затем добавляют вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 488 и фаллоидином 555. Инкубируют клетки в темной, влажной камере в течение 1,5 часов при комнатной температуре. После инкубации дважды промыть клетки инкубационным буфером в течение двух минут.
Окрашивают ядро, добавляя DAPI в разведении от одного до 2000 и инкубируют в течение пяти-10 минут при комнатной температуре в темноте. Приготовьте монтажную среду DABCO, используя 25 миллиграммов DABCO в 90% глицерина и 10% PBS. Чтобы раствориться должным образом, отрегулируйте рН до 8,6 с помощью спектрофотометрического сорта, разбавьте соляную кислоту и держите раствор на коромысле для перемешивания.
В качестве антиотбеливающего агента добавьте монтажную среду DABCO непосредственно на тарелку для визуализации, содержащую крышку снизу внизу. Подождите, по крайней мере, один-два часа и непосредственно приступайте к выполнению конфокальной визуализации. Чтобы идентифицировать туннельные нанотрубки, захватывайте Z-образные изображения иммуноокрашенных клеток с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, сначала выбирая каналы и последовательно щелкая необходимые лазеры в окнах трек один, трек два и трек три в конфокальном программном обеспечении.
Щелкните опцию TPMT под окном трека один, чтобы получить дифференциальные интерференционные контрастные изображения с флуоресцентными каналами. Выберите вкладку Приобретение программного обеспечения, щелкните вкладку Z-stack и дождитесь открытия окна. Затем нажмите кнопку Live Scan, чтобы сфокусировать ячейки в нижней части тарелки.
Выделите это сфокусированное изображение в качестве первого стека, а затем сфокусируйте вверх, чтобы увидеть самую верхнюю часть ячейки, и выберите ее в качестве последней стека. Остановите сканирование в реальном времени и щелкните число рядом с вкладкой Оптимальный, чтобы зафиксировать размер шага стеков, который определяет количество фрагментов и интервалы на основе толщины ячеек. Делайте последовательные изображения трех каналов DAPI, FITC и TRITC с помощью 405-нанометровых, 488-нанометровых и 561-нанометровых лазеров и делайте снимки со временем ожидания пикселей 1,02 микросекунды.
Захват изображений в DIC-канале с флуоресцентными каналами для наблюдения за границей ячейки. Откройте для анализа конфокальные изображения, сохраненные в формате данных czi в программном обеспечении Фиджи. Выберите параметр Hyperstack, чтобы просмотреть каждый Z-стек и канал изображения.
Прокрутите канал и полосы прокрутки Z-стека, чтобы выбрать точный стек конкретного интересующего канала. Затем сначала выберите окрашенный канал F-actin, прокрутив панель канала и вручную прокрутив Z-стеки, чтобы увидеть каждый стек по одному. Идентифицируйте окрашенные F-актином структуры, которые, по-видимому, соединяют клетки, которые видны в нижних частях Z-стеков и находятся близко к поверхности тарелки для визуализации с Z, равным двум в качестве нейритов.
Идентифицируйте туннельные нанотрубки, F-актин положительно парит от ячейки к клеточным каналам, прокручивая Z-стеки к вершине от Z равных четырем. Ищите нейриты вблизи нижних частей Z-стеков к поверхности и наблюдайте, что они начинают исчезать с прокруткой Z-стеков к вершине в Z, равной шести. Идентифицировать фосфо-PAK1 позитивные туннельные нанотрубки аналогично F-актиновым положительным туннельным нанотрубкам путем анализа парящей природы трубопроводов из Z-стеков.
Поскольку окрашивание фосфо-PAK1 слабее, чем окрашивание F-актином, ищите фосфо-PAK1 окрашенные туннельные нанотрубки при Z, равные четырем, и при Z, равные шести. Кроме того, понаблюдайте за изображениями ДВС-синдрома, чтобы убедиться, что окрашенные F-актином и фосфо-ПАК1 туннельные структуры нанотрубок являются мембранными проводниками между клетками. Кроме того, объедините каналы F-актина и фосфо-ПАК1, чтобы убедиться, что идентифицированные туннельные нанотрубки являются структурами совместного окрашивания F-актина и фосфо-ПАК1.
Чтобы количественно оценить туннельные нанотрубки, подсчитайте общее количество клеток и идентифицированные туннельные нанотрубки вручную и представьте числа в процентах. Чтобы отличить F-актин и бета-III тубулин с положительным туннелированием нанотрубок, таких как парящие каналы, от изображений Z-стека, объедините каналы F-актина и бета-III тубулина, а затем проанализируйте Z-стеки объединенных изображений. Ищите исключительно окрашенные F-актином туннельные нанотрубки, которые слабо видны при Z, равном трем, и заметные при Z, равные шести, и Z, равные девяти.
Аналогично идентифицируют F-актин и бета-III тубулин. двойные положительные туннельные нанотрубки, такие как парящие каналы при Z, равные шести и Z равные девяти. Идентифицировать другие F-актин и бета-III тубулин окрашенные ненависающие выступы из нижних частей Z-стеков.
Измерьте диаметр туннельных нанотрубок с помощью инструмента Line на Фиджи. Проверьте масштаб измерения, щелкнув Анализ, а затем установите масштаб, чтобы расстояние в пикселях автоматически устанавливалось из изображений czi. Измерьте диаметры туннельных нанотрубок в плоскости XY.
Используя плагин Volume Viewer на Фиджи, который позволяет 3D-перенарезку и 3D-визуализацию с пороговой поддержкой, разделите изображения Z-стека на отдельные каналы. Затем обрежьте одноканальные изображения Z-стека, чтобы использовать 3D-режим реконструкции, чтобы выделить одну или две туннельные нанотрубки или нейриты за раз. Закрепите одну туннельную нанотрубку или нейрит в плоскости XY и отметьте поперечные сечения доступа XZ и YZ.
Наблюдайте за нейритами в нижней части плоскости XZ, в плоскостях XZ и YZ, и туннельными нанотрубками в верхних Z-стеках. Выберите отдельные туннельные нанотрубки или нейриты, чтобы реконструировать 3D-вид объема в плоскости XZ. В 3D-реконструкции наблюдайте нейриты в нижней части Z-плоскости и туннельные нанотрубки, появляющиеся в виде парящих структур, соединяющих две клетки, не касаясь нижней Z-плоскости.
Конфокальные изображения Z-стека иммуноокрашенных клеток с F-актином и фосфо-PAK1 были проанализированы для идентификации туннельных нанотрубок. Кроме того, изображения DIC были проанализированы, чтобы убедиться, что F-актин и фосфо-PAK1 окрашенные туннельные структуры нанотрубок были мембранными проводниками между клетками. Клетки были дважды иммуноокрашены F-актином и бета-III тубулином, а туннельные нанотрубовидные F-актин и туннельные нанотрубкообразные F-актин и бета-III тубулин двойные положительные мембранные каналы отличались только от F-актин-положительных туннельных нанотрубок.
Туннельные нанотрубки, совместно экспрессируемые с фосфо-ПАК1 и F-актином, отличались от протрузий клеток других нейритов путем построения 3D-изображений объемного вида на основе их характеристики зависания между двумя клетками без прикосновения к субстрату. Использование правильного фиксатора важно, так как несовершенная фиксация образца может привести к быстрой протеолитической деградации белков-мишеней и снижению специфической иммунореактивности.
