L’absence de marqueurs spécifiques aux nanotubes tunneliers limite les progrès dans le domaine et il existe une demande croissante pour une méthode permettant d’identifier, de caractériser et de quantifier les nanotubes tunneliers. Les méthodes de détection automatique sont difficiles à mettre en œuvre sans l’expertise nécessaire pour développer un algorithme et/ou modifier l’algorithme existant, mais notre méthode manuelle est facile à mettre en œuvre avec une meilleure précision. Le transfert intercellulaire à longue distance via des nanotubes à effet tunnel est mis en œuvre de plusieurs façons dans divers modèles de maladies, notamment la pathologie neurodégénérative, la propagation virale et le cancer.
Ainsi, les études sur les nanotubes à effet tunnel pour comprendre leur rôle dans la pathogenèse sont importantes. Il est possible que les nanotubes tunneliers se brisent pendant le processus de coloration. Évitez d’utiliser des lames de couvercle et de monter sur les glissières, utilisez plutôt des antennes paraboliques d’imagerie à fond de verre.
Le protocole de fixation modifié aide à garder les nanotubes à effet tunnel intacts. La démonstration de la procédure sera Deepak KV, un doctorant du laboratoire de Sangeeta NAF. Pour commencer, laver les cellules témoins et oligomères A-bêta traitées deux fois avec du PBS pendant deux minutes avant la fixation.
Préparer la solution fixatrice de Karnovsky en utilisant un fixateur de formol à 2% et 2,5% de glutaraldéhyde dissous dans un tampon phosphate molaire 0,1 molaire de pH 7,2. Ensuite, fixez les cellules dans l’antenne d’imagerie en ajoutant la solution fixatrice de Karnovsky pendant 45 minutes à température ambiante. Préparer le tampon d’incubation en dissolvant 0,1 gramme de saponine dans cinq millilitres de FBS et dilué en ajoutant 95 millilitres de PBS.
Ensuite, lavez les cellules fixes deux fois à l’aide d’un tampon d’incubation pendant deux minutes. Après fixation, ajouter le premier anticorps contre phospho-PAK1, ajouter une dilution de un à 250 dans le tampon d’incubation et incuber pendant une nuit à quatre degrés Celsius dans une chambre sombre et humide. Le lendemain, après 24 heures d’incubation, lavez les cellules deux fois avec le tampon d’incubation pendant deux minutes.
Ajoutez ensuite un anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 488 et Phalloïdine 555. Incuber les cellules dans la chambre sombre et humide pendant 1,5 heure à température ambiante. Après l’incubation, lavez les cellules deux fois avec un tampon d’incubation pendant deux minutes.
Colorer le noyau en ajoutant du DAPI dans une dilution d’un à 2000 et incuber pendant cinq à 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Préparez le support de montage DABCO en utilisant 25 milligrammes de DABCO dans 90% de glycérol et 10% de PBS. Pour dissoudre correctement, ajuster le pH à 8,6 à l’aide d’acide chlorhydrique dilué de qualité spectrophotométrique et conserver la solution sur une bascule pour le mélange.
En tant qu’agent antiblanchissant, ajoutez le support de montage DABCO directement sur l’antenne d’imagerie contenant le couvercle en bas. Attendez au moins une à deux heures et procédez directement à l’imagerie confocale. Pour identifier les nanotubes tunnelis, capturez des images Z-stack de cellules immunocolorées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser en sélectionnant d’abord les canaux et en cliquant séquentiellement sur les lasers requis dans les fenêtres piste un, piste deux et piste trois dans le logiciel confocale.
Cliquez sur l’option TPMT sous la fenêtre de piste pour prendre les images de contraste d’interférence différentielle avec des canaux de fluorescence. Sélectionnez l’onglet Acquisition du logiciel, cliquez sur l’onglet Z-stack et attendez qu’une fenêtre s’ouvre. Cliquez ensuite sur Live Scan pour concentrer les cellules au bas de la boîte.
Sélectionnez cette image focalisée comme première pile, puis faites la mise au point vers le haut pour voir la partie supérieure de la cellule et sélectionnez-la comme dernière pile. Arrêtez l’analyse en direct et cliquez sur le nombre en regard de l’onglet Optimal pour fixer la taille des piles qui détermine le nombre de tranches et les intervalles en fonction de l’épaisseur des cellules. Prenez des images séquentielles de trois canaux de DAPI, FITC et TRITC avec des lasers de 405 nanomètres, 488 nanomètres et 561 nanomètres et capturez avec un temps de séjour de pixel de 1,02 microseconde.
Capturez des images dans le canal DIC avec des canaux de fluorescence pour observer la limite cellulaire. Ouvrez les images confocales enregistrées au format de données czi dans le logiciel Fiji pour analyse. Sélectionnez l’option Hyperstack pour voir chaque Z-stack et canal de l’image.
Faites défiler les barres de défilement du canal et de la pile Z pour sélectionner la pile exacte d’un canal d’intérêt particulier. Ensuite, sélectionnez d’abord le canal coloré F-actine en faisant défiler la barre de canal et faites défiler manuellement les piles Z pour voir chaque pile une par une. Identifier les structures colorées par la F-actine qui semblent relier les cellules visibles dans les parties inférieures des piles Z et proches de la surface de la boîte d’imagerie avec Z égal à deux comme neurites.
Identifiez les nanotubes tunnelis, les conduits de cellule à cellule positive de F-actine en faisant défiler les piles Z vers le haut de Z égal à quatre. Recherchez des neurites près des parties inférieures des piles Z vers la surface et observez qu’elles commencent à disparaître avec le défilement des piles Z vers le haut à Z égal à six. Identifier les nanotubes à effet tunnel positifs phospho-PAK1 de la même manière que les nanotubes à effet tunnel positif F-actine en analysant la nature planante des conduits des piles Z.
Comme la coloration phospho-PAK1 est plus faible que la coloration F-actine, recherchez les nanotubes à effet tunnel colorés phospho-PAK1 à Z égal à quatre et à Z égal à six. De plus, observez les images DIC pour vérifier que les structures de nanotubes à effet tunnel colorées par F-actine et phospho-PAK1 sont des conduits membranaires entre les cellules. De plus, fusionner les canaux F-actine et phospho-PAK1 pour vérifier que les nanotubes à effet tunnel identifiés sont des structures co-colorées F-actine et phospho-PAK1.
Pour quantifier les nanotubes tunnelis, comptez manuellement le nombre total de cellules et les nanotubes tunneliers identifiés et représentez les nombres en pourcentages. Pour distinguer les nanotubes à effet tunnel positif de la f-actine et de la tubuline bêta III comme les conduits stationnaires à partir d’images Z-stack, fusionnez les canaux de tubuline F-actine et bêta III, puis analysez les piles Z des images fusionnées. Recherchez exclusivement des nanotubes à effet tunnel colorés à la F-actine qui sont faiblement visibles à Z égal à trois et proéminent à Z égal à six et Z égal à neuf.
De même, identifier la F-actine et la tubuline bêta III. les nanotubes à effet tunnel doublement positifs comme les conduits stationnaires à Z égal à six et Z égal à neuf. Identifier d’autres protubérances non stationnaires colorées par la f-actine et la tubuline bêta III des parties inférieures des piles Z.
Mesurez le diamètre des nanotubes tunneliers à l’aide de l’outil Line aux Fidji. Vérifiez l’échelle de mesure en cliquant sur Analyser, puis définissez l’échelle de sorte que la distance en pixels soit définie automatiquement à partir des images czi. Mesurez les diamètres des nanotubes tunneliers sur le plan XY.
En utilisant le plug-in Volume Viewer aux Fidji, qui permet le redécoupage 3D et la visualisation 3D activée par seuil, divisez les images Z-stack en canaux individuels. Recadrez ensuite les images de la pile Z à canal unique pour utiliser la vue de reconstruction 3D afin de mettre en évidence un ou deux nanotubes ou neurites à effet tunnel à la fois. Épinglez un seul nanotube ou neurite à effet tunnel dans le plan XY et marquez les sections efficaces d’accès XZ et YZ.
Observez les neurites au bas du plan XZ, dans les plans XZ et YZ, et les nanotubes à effet tunnel dans les piles Z supérieures. Sélectionnez les nanotubes ou les neurites à effet tunnel individuels pour reconstruire la vue de volume 3D dans le plan XZ. Dans la reconstruction 3D, observez les neurites au bas du plan Z et les nanotubes en tunnel apparaissant comme des structures planantes reliant deux cellules sans toucher le plan Z inférieur.
Des images confocales de la pile Z de cellules immunocolorées avec F-actine et phospho-PAK1 ont été analysées pour identifier les nanotubes à effet tunnel. De plus, les images DIC ont été analysées pour vérifier que les structures de nanotubes à effet tunnel colorées par F-actine et phospho-PAK1 étaient des conduits membranaires entre les cellules. Les cellules ont été doublement immunocolorées avec de la F-actine et de la tubuline bêta III et la F-actine de type nanotube à effet tunnel et les conduits à double membrane positive de type nanotube à effet tunnel et de tubuline bêta III ont été distingués des seuls nanotubes à effet tunnel positifs F-actine.
Les nanotubes à effet tunnel co-exprimés avec la phospho-PAK1 et la F-actine ont été distingués des protubérances cellulaires d’autres névrites en construisant des images de vue de volume 3D basées sur leur caractéristique de vol stationnaire entre deux cellules sans toucher le substrat. L’utilisation de l’agent fixateur droit est importante car une fixation imparfaite de l’échantillon peut entraîner une dégradation protéolytique rapide des protéines cibles et une réduction de l’immunoréactivité spécifique.
