يوفر هذا البروتوكول معلومات عن تطور نموذج الورم بطريقة غير مدمرة. كما أنه يعطي مؤشرات على الاستجابة العلاجية من خلال أنظمة الأدوية بأكملها داخل مجاميع فردية بدلا من الاعتماد على عينات مطابقة العمر. تتطلب الطرق التقليدية للحصول على كثافة الخلايا وقابليتها للحياة داخل المجاميع تثبيت العينات وتقسيمها ، بينما توفر طريقتنا بيانات غير مدمرة.
لذلك ، يمكن تتبع التغييرات داخل مجموع واحد بمرور الوقت. ومن المتوقع أن تحسن هذه التقنية فهمنا للاستجابة للأدوية داخل المناطق السرية للنماذج المجمعة، مع ما يترتب على ذلك من آثار على مدى انعكاس هذه النماذج في استجابات الجسم الحي وتطبيقات فحص الأدوية. للبدء ، قم بإعداد 70 إلى 90٪ من مزارع خلايا الالتقاء من خطوط الخلايا المطلوبة في الظروف القياسية.
تفصل الطبقات الأحادية للخلايا عن قوارير ثقافتها باتباع طريقة التربسين القياسية وتضيف تعليق الخلية إلى أنبوب جهاز طرد مركزي. أضف 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى مقياس الدم وقم بالعد عبر الفحص المجهري لتحديد عدد الخلايا في التعليق. خلايا الكريات عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في الوسائط بالتركيز المطلوب من 2.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر.
بالنسبة للمعلقات المعدة باستخدام مصفوفة الغشاء السفلي ، قم بإزالة قارورة المصفوفة من التخزين بدرجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر ووضعها في الثلاجة لتذوب بين عشية وضحاها. قم بإعداد حاوية مع وسائط النمو وضعها في الثلاجة لمدة 10 دقائق حتى تبرد. باستخدام طرف ماصة مجمد ، أضف المصفوفة إلى الوسائط المبردة بحيث يكون التركيز النهائي لهذا المحلول هو 5٪ أضف 50 ميكرولتر من هذا الوسط إلى كل بئر من صفيحة 96 ذات القاع المستدير غير الملتصق بحيث يكون التركيز النهائي للمصفوفة في هذه الآبار 2.5٪ بعد إضافة تعليق الخلية.
بالنسبة للمعلقات المعدة بدون مصفوفة ، أضف 50 ميكرولتر من وسائط النمو العادية إلى كل بئر. قم بتوزيع 50 ميكرولتر من تعليق الخلايا في كل بئر. قم بالطرد المركزي للألواح عند 123 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مباشرة بعد البذر لضمان جمع حبيبات الخلايا في قاع كل بئر.
استخدام نظام OCT للتصوير الهيكلي. اضبط معدل المسح الضوئي A على 5.5 كيلوهرتز لجمع الصور عالية الدقة. اضبط مؤشر الانكسار على 1.33 للعينات في وسط سائل.
في نافذة معلمات الصورة على الجانب الأيسر من الشاشة، قم بتعيين مجال الرؤية عن طريق إدخال قيم X و Y و Z بحيث يتم تضمين العينة داخل منطقة الاهتمام هذه. انقر فوق وضع الاستحواذ ثلاثي الأبعاد ثم انقر فوق سجل لجمع مسح حجم 3D للعينة. لإنشاء إعادة بناء وحدة التخزين ، افتح Imaris وانتقل إلى ملف TIF المحول داخل الساحة الخاصة بهم.
انتقل إلى التحرير، ثم انقر على خصائص الصورة وأدخل حجم voxel من صورة OCT في مربعات XYZ المقابلة. بعد ذلك ، انقر فوق موافق. انقر فوق إضافة أسطح جديدة فوق شجرة الكائنات. في القائمة أسفل الشجرة ، انقر فوق تخطي الإنشاء التلقائي وقم بالتحرير يدويا.
داخل نافذة ضبط الشاشة، حرك السهمين الأحمر والأسود يدويا لتحسين التباين بين العينة والخلفية وتحسين تصور العينة. اضبط موضع الشريحة على الشريحة الموجودة على حافة واحدة من العينة. استخدم مفتاح الهروب لتغيير الماوس من وضع التنقل إلى وضع التحديد ثم انقر فوق رسم.
تتبع المخطط التفصيلي للمنطقة التي تعرض الإشارة يدويا. تقدم موضع الشريحة عن طريق إدخال الموضع التالي في مربع الإدخال. يجب أن يكون هذا الموضع التالي أقل من أو يساوي 100 شريحة في العينة أكثر من الموضع السابق.
تتبع المنطقة التي تعرض الإشارة يدويا. كرر هذه الخطوة عبر سمك العينة حتى يتم الوصول إلى الحافة المقابلة للعينة. ثم انقر فوق إنشاء Surface والقائمة اليسرى لخياطة هذه الشرائح معا.
أخيرا ، انقر فوق تحرير ، ثم انقر فوق تحديد قناع ، ثم انقر فوق موافق لإكمال إعادة بناء وحدة التخزين. للحصول على الكثافة الكلية لخلايا العينة، حدد إضافة بقع جديدة. في قائمة إعدادات الخوارزمية، قم بإلغاء تحديد جميع المربعات.
انقر على السهم الأزرق للانتقال إلى شاشة القناة المصدر. من القائمة المنسدلة التي تظهر، حدد القناة المقنعة. أدخل متوسط قطر الخلية للعينة في مربع قطر XY.
تأكد من التحقق من طرح الخلفية. انقر على السهم الأزرق للانتقال إلى شاشة تصنيف البقعة. في الرسم البياني في أسفل القائمة، انقر واسحب الحافة اليسرى للعتبة الصفراء إلى الحافة اليسرى للرسم البياني بحيث يتم تضمين جميع الكائنات في العتبة الصفراء المظللة.
ثم انقر على السهم الأخضر لإكمال إنشاء البقعة. احصل على عدد الكائنات المحددة بالنقر فوق الإحصاءات. ثم انقر فوق إجمالي وأخيرا انقر فوق إجمالي عدد النقاط.
انقر فوق السطح الذي تم إنشاؤه وانتقل إلى علامة التبويب جودة نمط الأسطح. قم بتغيير التحديد إلى نقطة الوسط وقم بتغيير عرض البكسل إلى أقل من 20 للحصول على أفضل رؤية. انتقل إلى الإحصاءات.
ثم انقر على مفصل، متبوعا بالموضع وسجل الموقع في المركز الأوسط. حدد إضافة إطار مرجعي جديد من القائمة الموجودة أعلى شجرة الكائن. حدد المربعات المرئية والثابتة بجوار X و Y في القائمة.
انقر واسحب مركز أيقونة الإطار المرجعي بحيث يكون متماشيا مع البقعة المركزية. قم بإلغاء تحديد مربعات XY المرئية وإصلاحها وحددها ل XZ. مرة أخرى ، انقر واسحب مركز رمز الإطار المرجعي بحيث يتماشى مع البقعة المركزية. أخيرا ، كرر هذا لمستوى YZ ، بالتناوب بين هذه المستويات الثلاثة الثابتة حتى يتوافق الإطار المرجعي تماما مع البقعة المركزية.
انقر نقرا مزدوجا فوق الإطار المرجعي في شجرة الكائن وأعد تسميته في الوسط أو ما شابه ذلك. انقر على المواقع التي تم إنشاؤها وانتقل إلى الإحصاءات. ثم انقر فوق مفصل، متبوعا بالإطار المرجعي للموضع.
انقر على الإطار المرجعي للموضع X حتى يتم فرزه من أعلى إلى أدنى قيمة. سجل أعلى قيمة للحصول على نصف قطر المجاميع. قم بإجراء حسابات يدوية لتحديد مواقع إضافية ذات أهمية.
للقيام بذلك، أضف 100 ميكرومتر إلى قيمة مركز X ثم استخدم قيم Y و Z لنقطة المركز لتحديد الموقع الأول على طول محور المركز. حدد إضافة نقاط جديدة. ثم حدد تخطي تحرير الإنشاء التلقائي يدويا.
اضغط مع الاستمرار على زر shift على لوحة المفاتيح وانقر في أي مكان على الشاشة لوضع مكان جديد. أدخل قيم موضع XYZ للموقع الأول للاهتمام. ثم حدد إضافة إطار مرجعي جديد وقم بمحاذاته فوق البقعة.
أضف 100 ميكرومتر إلى كل موقع X متسلسل. ضع الإطار المرجعي الأخير على بعد أقل من 50 ميكرومتر من نصف القطر الخارجي للعينة. انقر على المواقع التي تم إنشاؤها وانتقل إلى الإحصاءات.
في الزاوية السفلية اليسرى من القائمة ، انقر فوق تصدير جميع الإحصاءات إلى ملف واحفظ البيانات في جدول بيانات. افتح جدول البيانات. انتقل إلى علامة تبويب إطار مرجع المسافة من الأصل.
استخدم الدالة mod لتعيين كل مسافة رقميا إلى إطارها المرجعي المقابل. قم بتصفية القيم في هذا العمود للعمل مع المسافات في كل إطار مرجعي. لكل إطار من الإطارات المرجعية، احسب عدد الكائنات داخل 50 ميكرومتر من الإطار باستخدام الدالة COUNTIF.
تتوافق القيمة الناتجة مع عدد الخلايا في هذا القابس الإقليمي. اقسم هذه القيمة على حجم قابس 100 ميكرومتر للحصول على كثافة الخلية. كشف اختبار T للطالب عن كثافة خلايا أعلى بكثير في القلب الكروي مقارنة بالطبقات الانتقالية والخارجية لنماذج MDA-MB-231 الكروية.
تشير النتيجة إلى الضغط في هذا القلب الكروي بعد أربعة أيام. ضمن كل من نماذج AU565 و MDA-MB-231 المجمعة ، لا يبدو أن إضافة المصفوفة تؤثر على الحجم أو عدد الخلايا ، وبالتالي يبدو أن لها تأثيرا ضئيلا على انتشار الخلايا. بدلا من ذلك ، يبدو أن إضافة المصفوفة تعيد توزيع كثافة الخلايا مما يعزز الضغط الأساسي الكبير ويقلل من كثافة الخلايا في الطبقات الخارجية.
توفر هذه النتائج نظرة ثاقبة قيمة على الآليات الفيزيائية التي تمكن المصفوفة من خلالها من تجميع الخلايا في خطوط خلايا سرطان الثدي المختلفة. بالنظر بعد ذلك إلى أورام AU565 كروية محضرة باستخدام مصفوفة ، تمت معالجة الركام الناضج باستخدام تراستوزوماب وتم تقييم كثافة الخلايا الإقليمية من خلال نظام دوائي لمدة خمسة أيام. تم تعيين المقابس كل 100 ميكرومتر في جميع أنحاء سمك الركام.
لوحظت تقلبات طفيفة في كثافة الخلايا بمرور الوقت داخل 500 ميكرومتر داخلي من كل مجموع مما يشير إلى الحد الأدنى من موت الخلايا. إن تصور موت الخلايا كاستجابة دوائية إرشادية في الغالب في الطبقات الخارجية من كرويات الورم يتسق مع قضايا اختراق المخدرات في تراستوزوماب. يمكننا الآن قياس صلاحية الخلايا بشكل غير مدمر في المجاميع دون التضحية بالهيكل.
وهذا يتيح تقييم الاستجابة الطولية للأدوية في مجاميع الورم الفردية لتحديد الصفات الزمنية والاختراق للأدوية المرشحة المضادة للسرطان.
