이 프로토콜은 비파괴적인 방식으로 종양 모델 진행에 대한 정보를 제공한다. 또한 연령 일치 샘플에 의존하기보다는 단일 집계 내에서 전체 약물 요법을 통해 치료 반응의 징후를 제공합니다. 응집체 내에서 세포 밀도와 생존력을 얻는 기존의 방법은 샘플 고정 및 절편이 필요하지만 비파괴적으로 데이터를 제공합니다.
따라서 변경 사항은 시간이 지남에 따라 단일 집계 내에서 추적 할 수 있습니다. 이 기술은 집계 모델의 신중한 영역 내에서 약물 반응에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것으로 예상되며, 이러한 모델이 생체 내 반응 및 약물 스크리닝 응용 프로그램을 얼마나 잘 반영하는지에 대한 함의를 가지고 있습니다. 시작하기 위해, 표준 조건에서 원하는 세포주의 70 내지 90% 합류 세포 배양물을 준비한다.
표준 트립신화 방법에 따라 배양 플라스크에서 세포 단층을 분리하고 세포 현탁액을 원심분리 튜브에 첨가한다. 혈구계에 10 마이크로 리터의 세포 현탁액을 추가하고 현미경을 통해 카운트하여 현탁액의 세포 수를 결정하십시오. 펠릿 세포는 원심분리를 통해 배지에서 원하는 농도로 세포를 2.5배 10 밀리리터당 5번째 세포로 재현탁시켰다.
기저막 매트릭스로 제조된 현탁액의 경우, 매트릭스 바이알을 영하 20°C 저장소에서 제거하고 냉장고에 넣어 밤새 해동시킨다. 성장 매체가있는 용기를 준비하고 10 분 동안 냉장 보관하여 차갑게하십시오. 냉동 피펫 팁을 사용하여 매트릭스를 냉각 배지에 추가하여 이 용액의 최종 농도가 5%이 되도록 이 배지를 둥근 바닥의 각 웰에 50마이크로리터 추가하고, 부착되지 않은 96-웰 플레이트를 사용하여 이들 웰 내의 매트릭스의 최종 농도가 2.5%가 되도록 세포 현탁액을 첨가한 후 2.5%가 되도록 한다.
매트릭스없이 준비된 현탁액의 경우, 각 웰에 50 마이크로 리터의 일반 성장 배지를 첨가하십시오. 50 마이크로리터의 세포 현탁액을 각 웰에 분배하십시오. 플레이트를 시딩 직후 실온에서 10분 동안 123 G에서 원심분리하여 각 웰의 바닥에서 세포 펠릿의 수집을 보장한다.
구조 이미징을 위해 OCT 시스템을 활용하십시오. 고해상도 이미지 수집을 위해 A 스캔 속도를 5.5킬로헤르츠로 설정합니다. 액체 매질의 샘플에 대해 굴절률을 1.33으로 설정합니다.
화면 오른쪽에 있는 이미지 매개 변수 창에서 X, Y 및 Z 값을 입력하여 샘플이 이 관심 영역 내에 포함되도록 시야를 설정합니다. 3D 획득 모드를 클릭 한 다음 기록을 클릭하여 샘플의 3D 볼륨 스캔을 수집합니다. 볼륨 재구성을 생성하려면 Imaris를 열고 해당 경기장 내에서 변환된 TIF 파일로 이동합니다.
편집으로 이동 한 다음 이미지 속성을 클릭하고 OCT 이미지의 복셀 크기를 해당 XYZ 상자에 입력하십시오. 그런 다음 확인을 클릭하십시오. 객체 트리 위에 있는 새 서피스 추가를 클릭합니다. 트리 아래의 메뉴에서 자동 생성 건너 뛰기를 클릭하고 수동으로 편집하십시오.
디스플레이 조정 창 내에서 빨간색과 검은색 화살표를 수동으로 밀어 샘플과 배경 간의 대비를 향상시키고 샘플 시각화를 개선합니다. 샘플의 한쪽 가장자리에 있는 슬라이스에 대한 슬라이스 위치를 조정합니다. 이스케이프 키를 사용하여 마우스를 탐색 모드에서 선택 모드로 변경한 다음 그리기를 클릭합니다.
신호를 표시하는 영역의 윤곽선을 수동으로 추적합니다. 입력 상자에 다음 위치를 입력하여 슬라이스 위치를 진행합니다. 이 다음 위치는 이전 위치보다 샘플에 더 깊이 들어가는 100개 슬라이스보다 작거나 같아야 합니다.
신호를 표시하는 영역을 수동으로 추적합니다. 샘플의 반대쪽 가장자리에 도달할 때까지 샘플의 두께를 통해 이 단계를 반복합니다. 그런 다음 서피스 만들기 및 왼쪽 메뉴를 클릭하여 이러한 슬라이스를 함께 스티치하십시오.
마지막으로 편집을 클릭 한 다음 마스크 선택을 클릭 한 다음 확인을 클릭하여 볼륨 재구성을 완료하십시오. 샘플의 총 셀 밀도를 얻으려면 새 스팟 추가를 선택합니다. 알고리즘 설정 메뉴에서 모든 상자의 선택을 취소합니다.
파란색 화살표를 클릭하여 소스 채널 화면으로 이동합니다. 나타나는 드롭다운 메뉴에서 마스크된 채널을 선택합니다. XY 직경 상자에 샘플의 평균 셀 직경을 입력합니다.
배경 뺄셈이 선택되어 있는지 확인합니다. 파란색 화살표를 클릭하여 분류 지점의 화면으로 이동합니다. 메뉴 아래쪽에 있는 그래프에서 노란색 임계값의 왼쪽 가장자리를 클릭하고 그래프의 왼쪽 가장자리로 드래그하여 모든 개체가 노란색 음영처리된 임계값에 포함되도록 합니다.
그런 다음 녹색 화살표를 클릭하여 스팟 생성을 완료합니다. 통계를 클릭하여 식별된 개체 수를 가져옵니다. 그런 다음 전체를 클릭하고 마지막으로 총 스팟 수를 클릭합니다.
생성된 서피스를 클릭하고 서피스 스타일 품질 탭으로 이동합니다. 선택 영역을 중심점으로 변경하고 픽셀 너비를 20 미만으로 변경하여 최상의 가시성을 제공합니다. 통계로 이동합니다.
그런 다음 자세히(Detailed)를 클릭한 다음 위치(Position)를 클릭하고 중앙 지점의 위치를 기록합니다. 객체 트리 위의 메뉴에서 새 참조 프레임 추가를 선택합니다. 메뉴에서 X, Y 옆에 있는 표시 및 고정 상자를 선택합니다.
참조 프레임 아이콘의 중심을 클릭하고 드래그하여 중심 점과 일치하도록 합니다. XY 표시 및 수정 상자를 선택 해제하고 XZ에 대해 선택합니다. 다시 한 번 참조 프레임 아이콘의 중심을 클릭하고 드래그하여 중심 지점과 일치하도록 합니다. 마지막으로, YZ 평면에 대해 이 작업을 반복하고, 참조 프레임이 중심 지점과 완벽하게 정렬될 때까지 이 세 개의 고정 평면을 번갈아 가며 반복합니다.
개체 트리에서 참조 프레임을 두 번 클릭하고 가운데 또는 이와 유사한 이름을 바꿉니다. 생성 된 지점을 클릭하고 통계로 이동하십시오. 그런 다음 자세히를 클릭하고 위치 참조 프레임을 클릭합니다.
가장 높은 값에서 가장 낮은 값으로 정렬될 때까지 위치 X 참조 프레임을 클릭합니다. 집계의 반지름을 얻기 위해 가장 높은 값을 기록하십시오. 수동 계산을 수행하여 추가 관심 위치를 결정합니다.
이렇게 하려면 X 중심 값에 100마이크로미터를 추가한 다음 중심점의 Y 및 Z 값을 사용하여 중심축을 따라 첫 번째 위치를 정의합니다. 새 스폿 추가를 선택합니다. 그런 다음 자동 생성 편집 건너뛰기를 수동으로 선택합니다.
키보드의 Shift 버튼을 누른 상태에서 화면의 아무 곳이나 클릭하여 새 지점을 배치하십시오. 첫 번째 관심 위치에 대한 XYZ 위치 값을 입력합니다. 그런 다음 새 참조 프레임 추가를 선택하고 그 지점 위에 정렬합니다.
각 순차적 X 위치에 100마이크로미터를 추가합니다. 마지막 기준 프레임을 샘플의 외부 반지름에서 50마이크로미터 미만으로 배치합니다. 생성 된 지점을 클릭하고 통계로 이동하십시오.
메뉴의 오른쪽 하단에서 모든 통계를 파일로 내보내기를 클릭하고 데이터를 스프레드 시트에 저장하십시오. 스프레드시트를 엽니다. 원점 참조 프레임 탭으로부터의 거리로 이동합니다.
mod 함수를 사용하여 각 거리를 해당 참조 프레임에 숫자로 할당합니다. 이 열의 값을 필터링하여 각 참조 프레임의 거리에 대해 작업합니다. 각 참조 프레임에 대해 COUNTIF 함수를 사용하여 프레임의 50마이크로미터 이내의 개체 수를 계산합니다.
결과 값은 해당 지역 플러그의 셀 수에 해당합니다. 이 값을 100 마이크로미터 플러그의 부피로 나누어 셀 밀도를 구한다. 스튜던트 T 테스트는 MDA-MB-231 스페로이드 모델의 전이 및 외부 층보다 스페로이드 코어에서 훨씬 높은 세포 밀도를 나타냈다.
결과는 나흘 후이 스페로이드 코어의 압축을 나타냅니다. AU565 및 MDA-MB-231 응집체 모델 둘 다에서, 매트릭스의 첨가는 부피 또는 세포 수에 영향을 미치는 것으로 보이지 않으며, 따라서 세포 증식에 무시할 수 있는 영향을 미치는 것으로 보인다. 오히려, 매트릭스 첨가는 셀 밀도를 재분배하여 상당한 코어 압축을 촉진하고 외부 층에서 셀 밀도를 감소시키는 것으로 보인다.
이러한 발견은 매트릭스가 다른 유방암 세포주에서 세포 응집을 가능하게하는 물리적 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 다음으로 매트릭스로 제조된 AU565 종양 스페로이드를 살펴보면, 성숙된 응집체를 트라스투주맙으로 처리하고, 5일 약물 요법을 통해 지역 세포 밀도를 평가하였다. 플러그는 응집체의 두께에 걸쳐 100 마이크로미터마다 설정되었다.
세포 밀도의 사소한 변동은 최소한의 세포 사멸을 나타내는 각 응집체의 내부 500 마이크로미터 내에서 시간에 따라 관찰되었다. 종양 구상체의 외층에서 주로 약물 반응을 나타내는 세포 사멸의 시각화는 트라스투주맙의 약물 침투 문제와 일치한다. 우리는 이제 구조를 희생하지 않고 응집체에서 세포 생존력을 비파괴적으로 측정 할 수 있습니다.
이를 통해 단수 종양 응집체에서 종단 약물 반응을 평가하여 후보 항암제의 시간적 및 침투 특성을 확인할 수 있습니다.
