Этот протокол предоставляет информацию о прогрессировании опухолевой модели неразрушающим образом. Он также дает указания на терапевтический ответ через целые схемы лечения в единичных агрегатах, а не полагается на образцы соответствия возрасту. Традиционные методы получения плотности и жизнеспособности клеток в агрегатах требуют фиксации и секционирования образцов, в то время как наши данные предоставляются неразрушающе.
Таким образом, изменения могут отслеживаться в рамках одной совокупности с течением времени. Ожидается, что этот метод улучшит наше понимание реакции на наркотики в незаметных областях агрегированных моделей, что повлияет на то, насколько хорошо эти модели отражают ответы in vivo и заявки на скрининг лекарств. Для начала подготовьте от 70 до 90% слияния клеточных культур нужных клеточных линий в стандартных условиях.
Отделяют клеточные монослои от колб для культивирования в соответствии со стандартным методом трипсинизации и добавляют клеточную суспензию в центрифужную трубку. Добавьте 10 микролитров клеточной суспензии к гемоцитометру и подсчитайте с помощью микроскопии, чтобы определить количество клеток в суспензии. Пеллетные ячейки путем центрифугирования и повторного суспендирования клеток в средах при желаемой концентрации 2,5 раза 10 к пятой ячейке на миллилитр.
Для суспензий, приготовленных с помощью матрицы базальной мембраны, снимите флакон с температурой минус 20 градусов Цельсия и поместите в холодильник для размораживания на ночь. Подготовьте контейнер с питательной средой и поставьте в холодильник на 10 минут до охлаждения. С помощью замороженного наконечника пипетки добавляют матрицу к охлажденной среде таким образом, чтобы конечная концентрация этого раствора составляла 5%. Добавьте 50 микролитров этой среды в каждую лунку круглой нижней, неадгезивной 96-луночной пластины таким образом, чтобы конечная концентрация матрицы в этих скважинах составляла 2,5% после добавления клеточной суспензии.
Для суспензий, приготовленных без матрицы, добавьте 50 микролитров простой среды роста в каждую лунку. Дозируйте 50 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку. Центрифугируйте пластины при 123 г в течение 10 минут при комнатной температуре сразу после посева, чтобы обеспечить сбор ячейки гранулы на дне каждой лунки.
Используйте систему OCT для структурной визуализации. Установите скорость сканирования A на 5,5 килогерц для сбора изображений с высоким разрешением. Установите показатель преломления равным 1,33 для образцов в жидкой среде.
В окне параметров изображения в правой части экрана задайте поле зрения, введя значения X, Y и Z таким образом, чтобы образец охватывал эту область интереса. Нажмите «Режим 3D-сбора», а затем нажмите «Запись», чтобы собрать 3D-сканирование объема образца. Чтобы создать реконструкцию тома, откройте Imaris и перейдите к преобразованному TIF-файлу на его арене.
Перейдите к редактированию, затем нажмите «Свойства изображения» и введите размер вокселя из изображения центра развертывания Office в соответствующие поля XYZ. Затем нажмите OK. Нажмите кнопку Добавить новые поверхности над деревом объектов. В меню под деревом нажмите Пропустить автоматическое создание и отредактируйте вручную.
В окне настройки дисплея вручную сдвиньте красные и черные стрелки, чтобы повысить контраст между образцом и фоном и улучшить визуализацию образца. Отрегулируйте положение фрагмента в соответствии с фрагментом на одном краю образца. Используйте клавишу escape, чтобы переключить мышь из режима навигации в режим выбора, а затем нажмите кнопку Нарисовать.
Вручную проследите контур области, отображающей сигнал. Переместите положение фрагмента, введя следующую позицию в поле ввода. Эта следующая позиция должна быть меньше или равна 100 срезам дальше в образец, чем предыдущая.
Вручную отследите область, отображающую сигнал. Повторяйте этот шаг по толщине образца до тех пор, пока не будет достигнут противоположный край образца. Затем нажмите «Создать поверхность» и меню слева, чтобы сшить эти фрагменты вместе.
Наконец, нажмите «Редактировать», затем нажмите «Выбор маски», затем нажмите «ОК», чтобы завершить реконструкцию тома. Чтобы получить общую плотность клеток образца, выберите Добавить новые пятна. В меню настроек алгоритма снимите флажки со всех полей.
Нажмите на синюю стрелку, чтобы перейти на экран исходного канала. В появившемся раскрывающемся меню выберите Маскированный канал. Введите средний диаметр ячейки для образца в поле диаметра XY.
Убедитесь, что вычитание фона проверено. Нажмите на синюю стрелку, чтобы перейти на экран классифицированного места. На графике в нижней части меню щелкните и перетащите левый край желтого порога к левому краю графика, чтобы все объекты были включены в желтый затененный порог.
Затем нажмите на зеленую стрелку, чтобы завершить создание пятна. Получите количество идентифицированных объектов, нажав на Статистику. Затем нажмите «Все» и, наконец, нажмите «Общее количество мест».
Щелкните созданную поверхность и перейдите на вкладку качества стиля поверхностей. Измените выделение на Центральную точку и измените ширину пикселя на менее 20 для лучшей видимости. Перейдите в раздел Статистика.
Затем нажмите «Подробно», затем «Положение» и запишите местоположение в центральном месте. Выберите «Добавить новую систему отсчета» в меню над деревом объектов. Установите видимые и фиксированные поля рядом с X, Y в меню.
Щелкните и перетащите центр значка системы отсчета так, чтобы он находился на одной линии с центральным пятном. Снимите флажки XY видимые и фиксированные поля и выберите их для XZ. Еще раз щелкните и перетащите центр значка системы отсчета так, чтобы он находился на одной линии с центральным пятном. Наконец, повторите это для плоскости YZ, чередуя эти три фиксированные плоскости до тех пор, пока система отсчета идеально не выровняется с центральным пятном.
Дважды щелкните систему отсчета в дереве объектов и переименуйте ее в центр или аналогичную систему. Нажмите на созданные места и перейдите в раздел Статистика. Затем щелкните Подробно, а затем Позиция Эталонная система.
Нажимайте на систему отсчета позиции X, пока она не отобразится от самого высокого к самому низкому значению. Запишите наибольшее значение, чтобы получить радиус агрегатов. Выполните ручные вычисления для определения дополнительных мест, представляющих интерес.
Для этого добавьте 100 микрометров к центральному значению X, а затем используйте значения Y и Z центральной точки для определения первого местоположения вдоль центральной оси. Выберите Добавить новые места. Затем выберите Пропустить редактирование автоматического создания вручную.
Удерживайте кнопку shift на клавиатуре и нажмите в любом месте экрана, чтобы создать новое место. Введите значения позиции XYZ для первого интересующего местоположения. Затем выберите «Добавить новую систему отсчета» и выровняйте ее по месту.
Добавьте 100 микрометров к каждому последовательному местоположению X. Поместите последнюю систему отсчета менее чем на 50 микрометров от внешнего радиуса образца. Нажмите на созданные места и перейдите в раздел Статистика.
В правом нижнем углу меню нажмите экспортировать всю статистику в файл и сохраните данные в электронную таблицу. Откройте электронную таблицу. Перейдите на вкладку Расстояние от исходной системы отсчета.
Используйте функцию mod для численного назначения каждого расстояния соответствующей системе отсчета. Отфильтруйте значения в этом столбце для работы с расстояниями в каждой системе отсчета. Для каждой из систем отсчета рассчитайте количество объектов в пределах 50 микрометров от кадра с помощью функции СЧЁТЕСЛИ.
Результирующее значение соответствует количеству ячеек в этой региональной заглушке. Разделите это значение на объем 100-микрометровой пробки, чтобы получить плотность ячейки. Т-тестирование Стьюдента показало значительно более высокую плотность клеток в сфероидном ядре, чем в переходном и внешнем слоях для моделей сфероидов MDA-MB-231.
Результат указывает на уплотнение в этом сфероидном ядре через четыре дня. В рамках агрегированных моделей AU565 и MDA-MB-231 добавление матрицы, по-видимому, не влияет на объем или количество клеток и, таким образом, оказывает незначительное влияние на пролиферацию клеток. Скорее, добавление матрицы, по-видимому, перераспределяет плотность клеток, способствуя значительному уплотнению ядра и снижению плотности клеток во внешних слоях.
Эти результаты дают ценную информацию о физических механизмах, с помощью которых матрица обеспечивает агрегацию клеток в различных клеточных линиях рака молочной железы. Глядя далее на сфероид опухолей AU565, приготовленный с помощью матрицы, зрелые агрегаты обрабатывали трастузумабом, а плотность регионарных клеток оценивали с помощью пятидневного режима приема лекарств. Заглушки устанавливались через каждые 100 микрометров по всей толщине агрегатов.
Незначительные колебания плотности клеток наблюдались с течением времени во внутренних 500 микрометрах каждого агрегата, что указывает на минимальную гибель клеток. Визуализация гибели клеток как индикативного лекарственного ответа в основном во внешних слоях сфероидов опухоли согласуется с проблемами проникновения трастузумаба. Теперь мы можем неразрушающе измерять жизнеспособность клеток в агрегатах, не жертвуя структурой.
Это позволяет оценить продольный лекарственный ответ в единичных опухолевых агрегатах для выявления временных и проникающих качеств противораковых препаратов-кандидатов.
