Bu, küçük hücre dışı vezikülleri mezenkimal kök hücrelerden izole etmek ve konsantre etmek için basit ve zaman etkili bir protokoldür. Bu tekniğin çoğu laboratuvarda benimsenmesi kolaydır, çünkü tezgah üstü bir terazidir ve operasyonlar için sadece basit aletler gerektirir. Küçük hücre dışı veziküllerin bir kısmını izole etmek için, en az yüz milyon hücre elde etmek için büyük ölçekte büyüyen hücreleri öneririz.
Basit gibi görünse de, bu tekniğin bazı kritik adımları görsel gösterim yoluyla daha iyi bilgilendirilir. Araştırmacıların deneyimlerimizden öğrenebileceklerini ve becerileri güvenle öğrenebileceklerini umuyoruz. Doktora öğrencimiz Mr.Chan, Hong Hao, mezenkimal kök hücrelerden küçük hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu konusundaki deneyimlerimiz boyunca size rehberlik edecektir.
Başlamak için, hücre kalıntılarını gidermek için şartlandırılmış ortamı 200 g'da dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin. 220 nanometreden büyük parçacıkları çıkarmak için süpernatantı 0.22 mikrometre filtreden toplayın ve filtreleyin. Santrifüjlü filtre ünitesini 30 mililitre 0,2 mikrometre filtrelenmiş fosfat tamponlu salin ile doldurdu.
Daha sonra santrifüj filtre ünitesini dört santigrat derecede beş dakika boyunca 3.500g'de santrifüj edin. Çözeltiyi filtrat çözelti kabına atın. Santrifüjlü filtre ünitesine 70 mililitre filtrelenmiş şartlandırılmış ortam ekleyin ve üniteyi dört santigrat derecede 3.500 g'da santrifüj edin.
Çözeltiyi filtrat çözelti kabına atın. 30 mililitre filtrelenmiş fosfat tamponlu salin ekleyin ve üniteyi dört santigrat derecede 3.500g'da santrifüj edin. Filtre ünitesine bir konsantre toplama kabı takın ve saflaştırılmış küçük hücre dışı vezikülleri elde etmek için dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.000g'da santrifüjü tersine çevirin.
Küçük hücre dışı vezikülleri 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresinden geçirin. Numuneleri yeni tüplere aktarın ve daha fazla analiz için 80 santigrat derecede saklayın. Nanopartikül izleme analizine başlamak için, izole edilmiş insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücreleri, filtrelenmiş fosfat tamponlu salin içindeki küçük hücre dışı vezikülleri çerçeve başına 20 ila 100 partiküle seyreltin.
Bir mililitrelik tek kullanımlık şırıngalar kullanarak seyreltilmiş numunenin bir mililitresini anti-A odasına sokun. Ölçüm ayarlarını buna göre ayarlayın. Kamera Düzeyi'ni düzey 14'e ayarlayın.
Her ölçüm için standart ölçüme tıklayın ve seyreltmeyi buna göre ayarlayın. Ardından, Capture, Start Camera (Kamerayı Başlat) seçeneğini tıklayın ve küçük EV'leri görselleştirmek için Kamera Seviyesi'ni 14 olarak ayarlayın. Ölçümü başlatmak için Oluştur'u tıklayın, ardından Komut Dosyası Çalıştır'ı tıklayın ve dosyaların kaydedilmesi gereken konumu seçin.
Örnekle ilgili gerekli ayrıntıları girin ve Tamam'ı tıklatın. Koda devam etmek için Tamam ayarını tıklatın ve ölçümü başlatmak için Tamam'ı tıklatın. Ölçüm kaydedildikten sonra, sonuçları kare başına 10 ila 100 kırmızı çarpı işareti içerecek şekilde beş algılama eşiğiyle analiz edin. Ve mavi haç sayısı beş ile sınırlıdır.
Komut dosyasına devam etmek ve analizi başlatmak için Tamam'ı Ayarlama'yı tıklatın. Verileri ayarlanan konuma dışa aktarmak için komut dosyası tamamlama bildiriminde ve dışa aktarmada Tamam'ı tıklatın. İnsan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücreleri, küçük hücre dışı vezikülleri buz gibi soğuk radyoimmünopresipitasyon testi lizis tamponu ile lize edin ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin.
Süpernatantı 200g'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj yaptıktan sonra toplayın. Bir BCA testi kullanarak proteini sayısallaştırın. Jel elektroforez setini buna göre monte edin ve protein istifleme jelinin sonuna ulaşana kadar 90 voltta jel elektroforezi gerçekleştirin.
Çözme jelinin sonuna kadar proteinleri ayırmak için voltajı 200 volta değiştirin. Proteinleri jelden bir saat boyunca 15 voltta bir poliviniliden diflorür membranına aktarmak için yarı kuru transfer gerçekleştirin. PVDF membranını, tris tamponlu salin içinde% 3 sığır serum albümini ile% 0.1 Tween 20 oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda bir saat boyunca bloke edin.
PVDF membranını, sürekli çalkalayarak gece boyunca dört santigrat derecede birincil antikorlarla inkübe edin. Ertesi gün, PVDF zarını TBST ile her biri beş kez ve beş dakika yıkayın ve oda sıcaklığında ajitasyonla bir saat boyunca ikincil bir antikor ile inkübe edin. Yine, PVDF membranını TBST ile beş kez yıkayın ve membranı bir kemilüminesan algılama reaktifi kullanarak şarj bağlantılı bir görüntüleyicide görselleştirin.
ImageJ yazılımını kullanarak proteinlerin ekspresyon seviyesini analiz edin. İlk olarak, görüntü dosyasını ImageJ'de açın. Parlaklığı ve kontrastı ayarlayarak görüntünün kalitesini artırın.
Lekeler açıkça görünene kadar görüntüyü ayarlayın. Uygula düğmesine tıklayın ve görüntüleri TIFF formatında kaydedin. İletim elektron mikroskobu tabanlı analiz için, insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin bir kısmını, dört parça filtrelenmiş fosfat tamponlu salin ile örneklenen küçük hücre dışı veziküllerin bir kısmını, toplam 10 mikrolitrelik bir hacme kadar seyreltin ve karbon kaplı bir bakır ızgara üzerinde 15 dakika boyunca inkübe edin.
Fazla numuneyi bir laboratuvar mendili kullanarak çıkarın ve üç dakika boyunca hava ile kurumasını bekleyin. Numuneyi üç dakika boyunca boyamak için 10 mikrolitre% 1 fosfotungstik asit çözeltisini inkübe edin. Fazla% 1'lik fosfotungstik asit çözeltisini bir laboratuvar mendili kullanarak çıkarın ve bir transmisyon elektron mikroskobu altında görüntülemek için üç dakika boyunca hava kurumasını bekleyin.
İnsan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücreler küçük hücre dışı veziküller 53 nanometrelik bir parçacık boyutu moduna sahipken, parçacık boyutunun diğer önemli zirveleri 96 ve 115 nanometre idi. NTA tarafından ölçülen insan göbek kordonu kaynaklı MSC küçük hücre dışı veziküllerin konsantrasyonu, mililitre başına 7.75 kat 10 ila 10. parçacık idi. BCA testi ile ölçülen insan göbek kordonu kaynaklı MSC küçük hücre dışı veziküllerin protein konsantrasyonu, mililitre başına yaklaşık 80 mikrogram idi.
Batı lekeleme analizinde, insan göbek kordonu kaynaklı MSC küçük hücre dışı veziküller, ekzozomal belirteçler CD9, CD81 ve TSG101 için pozitif bantlar gösterdi, ancak GRP94 için negatifti. İzole edilmiş insan göbek kordonu kaynaklı MSC küçük hücre dışı veziküller, boyutlarını ve morfolojilerini belirlemek için TEM altında görüntülendi. İnsan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücreler, küçük hücre dışı veziküller yaklaşık 100 nanometre büyüklüğünde ve fincan benzeri çift katmanlı bir zar yapısı gösterdi.
Protokolün başarılı bir şekilde geliştirilmesiyle, artık rejeneratif ilaçlarda mezenkimal kök hücrelerden türetilen küçük hücre dışı veziküllerin terapötik potansiyellerini ortaya çıkarabiliriz.
