Это простой и эффективный по времени протокол для выделения и концентрации небольших внеклеточных везикул из мезенхимальных стволовых клеток. Этот метод легко использовать в большинстве лабораторий, поскольку это настольные весы, требующие только простых инструментов для операций. Чтобы выделить небольшие внеклеточные везикулы, мы рекомендуем выращивать клетки в больших масштабах, чтобы получить как минимум сто миллионов клеток.
Хотя это звучит просто, некоторые важные шаги этой техники лучше информируются посредством визуальной демонстрации. Мы надеемся, что исследователи смогут извлечь уроки из нашего опыта и уверенно овладеть навыками. Наш аспирант, г-н Чан, Хонг Хао, расскажет вам о нашем опыте выделения и характеристики небольших внеклеточных везикул из мезенхимальных стволовых клеток.
Для начала центрифугируйте кондиционированную среду при 200 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить клеточный мусор. Соберите и отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр размером 0,22 микрометра, чтобы удалить частицы размером более 220 нанометров. Заполнен центробежный фильтрующий блок 30 миллилитрами 0,2 микрометра фильтрованного фосфатно-буферного физиологического раствора.
Затем центрифугируйте центробежный фильтрующий блок на 3 500 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Вылейте раствор в чашку с раствором фильтрата. Добавьте 70 миллилитров отфильтрованной кондиционированной среды в центробежный фильтрующий блок и центрифугируйте установку при 3 500 г при четырех градусах Цельсия.
Вылейте раствор в чашку с раствором фильтрата. Добавьте 30 миллилитров фильтрованного фосфатно-буферного физиологического раствора и центрифугируйте устройство при 3 500 г при четырех градусах Цельсия. Установите чашку для сбора концентрата на фильтрующий блок и обратную центрифугу на 1 000 г в течение двух минут при четырех градусах Цельсия, чтобы получить очищенные мелкие внеклеточные везикулы.
Отфильтруйте мелкие внеклеточные везикулы через шприцевой фильтр размером 0,22 микрометра. Перенесите образцы в новые пробирки и храните их при температуре 80 градусов Цельсия для дальнейшего анализа. Чтобы начать анализ отслеживания наночастиц, разбавьте изолированные мезенхимальные стволовые клетки, полученные из пуповины человека, небольшие внеклеточные везикулы в фильтрованном фосфатно-буферном физиологическом растворе до 20-100 частиц в кадре.
Введите один миллилитр разбавленного образца в анти-А-камеру с помощью одноразовых шприцев объемом один миллилитр. Установите соответствующие настройки измерения. Отрегулируйте уровень камеры до уровня 14.
Для каждого измерения щелкните стандартное измерение и установите соответствующее разбавление. Затем нажмите «Захват», «Запустить камеру» и установите уровень камеры на 14, чтобы визуализировать небольшие электромобили. Чтобы начать измерение, нажмите кнопку «Создать», затем нажмите кнопку «Выполнить сценарий» и выберите расположение, в котором необходимо сохранить файлы.
Введите необходимые сведения об образце и нажмите кнопку ОК. Щелкните параметр ОК, чтобы продолжить сценарий, и нажмите кнопку ОК, чтобы начать измерение. После того, как измерение было записано, проанализируйте результаты с порогом обнаружения пять, чтобы включить от 10 до 100 красных крестов на кадр. А количество синих крестов ограничено пятью.
Нажмите кнопку Настройка ОК, чтобы продолжить сценарий и начать анализ. Нажмите кнопку ОК в уведомлении о завершении скрипта и экспорте, чтобы экспортировать данные в заданное место. Лизируйте мезенхимальные стволовые клетки, полученные из пуповины человека, небольшие внеклеточные везикулы с помощью ледяного радиоиммунопреципитации, анализа лизиса, буфера для лизиса и инкубируйте в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.
Соберите надосадочную жидкость после центрифугирования при 200 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Количественно определите белок с помощью анализа BCA. Соберите набор для гель-электрофореза соответствующим образом и выполняйте гель-электрофорез при 90 вольтах, пока белок не достигнет конца геля для укладки.
Измените напряжение на 200 вольт, чтобы отделить белки до конца рассасывающегося геля. Выполните полусухой перенос для переноса белков из геля в мембрану из поливинилидендифторида при напряжении 15 вольт в течение одного часа. Заблокируйте мембрану PVDF 3%-ным бычьим сывороточным альбумином в трис-буферном физиологическом растворе 0,1% Tween 20 в течение одного часа на шейкере при комнатной температуре.
Инкубируйте мембрану PVDF с первичными антителами при четырех градусах Цельсия в течение ночи при постоянном встряхивании. На следующий день промойте мембрану PVDF пять раз и по пять минут TBST и далее инкубируйте со вторичным антителом в течение одного часа при перемешивании при комнатной температуре. Опять же, промойте мембрану PVDF TBST пять раз и визуализируйте мембрану в тепловизоре с зарядовой связью с помощью хемилюминесцентного реагента для обнаружения.
Проанализируйте уровень экспрессии белков с помощью программного обеспечения ImageJ. Сначала откройте файл изображения в ImageJ. Улучшите качество изображения, отрегулировав яркость и контрастность.
Корректируйте изображение до тех пор, пока кляксы не станут хорошо видны. Нажмите кнопку «Применить» и сохраните изображения в формате TIFF. Для анализа на основе просвечивающего электронного микроскопа разбавьте одну часть образца небольших внеклеточных везикул, полученных из мезенхимальных стволовых клеток пуповины, четырьмя частями отфильтрованного фосфатно-буферного физиологического раствора до общего объема 10 микролитров и инкубируйте на медной сетке с углеродным покрытием в течение 15 минут.
Удалите излишки образца с помощью лабораторной салфетки и дайте ему высохнуть на воздухе в течение трех минут. Инкубируйте 10 микролитров 1%-ного раствора фосфовольфрамовой кислоты, чтобы окрасить образец в течение трех минут. Удалите излишки 1%-ного раствора фосфовольфрамовой кислоты с помощью лабораторной салфетки и дайте ему высохнуть на воздухе в течение трех минут для получения изображения под просвечивающим электронным микроскопом.
Небольшие внеклеточные везикулы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека, имеют размер частиц 53 нанометра, в то время как другие значимые пики размера частиц составляли 96 и 115 нанометров. Концентрация малых внеклеточных везикул МСК, полученных из пуповины человека, измеренная с помощью NTA, составляла 7,75 от 10 до 10 частиц на миллилитр. Концентрация белка в малых внеклеточных везикулах МСК, полученных из пуповины человека, измеренная с помощью анализа BCA, составляла примерно 80 микрограммов на миллилитр.
В анализе вестерн-блоттинга небольшие внеклеточные везикулы МСК, полученные из пуповины человека, продемонстрировали положительные полосы для экзосомальных маркеров CD9, CD81 и TSG101, но были отрицательными для GRP94. Изолированные небольшие внеклеточные везикулы, полученные из пуповины человека, были визуализированы в рамках ПЭМ для определения их размера и морфологии. Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из пуповины человека, небольшие внеклеточные везикулы размером около 100 нанометров и показали чашеобразную двухслойную мембранную структуру.
Благодаря успешной разработке протокола мы теперь можем раскрыть терапевтический потенциал мезенхимальных стволовых клеток, полученных из небольших внеклеточных везикул, в регенеративных лекарствах.
