Este es un protocolo simple y efectivo para aislar y concentrar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales. Esta técnica es fácil de adoptar en la mayoría de los laboratorios, ya que es una báscula de sobremesa y solo requiere instrumentos simples para las operaciones. Para aislar una de pequeñas vesículas extracelulares, recomendamos cultivar células a gran escala para obtener un mínimo de cien millones de células.
Aunque suene simple, ciertos pasos críticos de esta técnica están mejor informados a través de la demostración visual. Esperamos que los investigadores puedan aprender de nuestra experiencia y dominar las habilidades con confianza. Nuestro estudiante de doctorado, el Sr. Chan, Hong Hao, lo guiará a través de nuestra experiencia en aislamiento y caracterizaciones de pequeñas vesículas extracelulares a partir de células madre mesenquimales.
Para comenzar, centrifugar el medio acondicionado a 200 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los restos celulares. Recoja y filtre el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micrómetros para eliminar partículas mayores de 220 nanómetros. Llenó una unidad de filtro centrífugo con 30 mililitros de solución salina tamponada con fosfato filtrado de 0,2 micrómetros.
Luego centrifugar la unidad de filtro centrífugo a 3, 500 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche la solución en el vaso de solución de filtrado. Agregue 70 mililitros de medio acondicionado filtrado en la unidad de filtro centrífugo y centrifugar la unidad a 3, 500 g a cuatro grados centígrados.
Deseche la solución en el vaso de solución de filtrado. Agregue 30 mililitros de solución salina tamponada con fosfato filtrado y centrifugar la unidad a 3, 500 g a cuatro grados centígrados. Instale una taza de recolección de concentrado en la unidad de filtro y una centrífuga inversa a 1, 000 g durante dos minutos a cuatro grados centígrados para obtener las pequeñas vesículas extracelulares purificadas.
Filtre las pequeñas vesículas extracelulares a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros. Transfiera las muestras a nuevos tubos y guárdelas a 80 grados centígrados para su posterior análisis. Para comenzar el análisis de seguimiento de nanopartículas, diluya las pequeñas vesículas extracelulares aisladas de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano en solución salina tamponada con fosfato filtrado a 20 a 100 partículas por cuadro.
Introducir un mililitro de la muestra diluida en la cámara anti-A utilizando jeringas desechables de un mililitro. Establezca los ajustes de medición en consecuencia. Ajuste el nivel de la cámara al nivel 14.
Para cada medición, haga clic en la medición estándar y establezca la dilución en consecuencia. A continuación, haga clic en Capturar, Iniciar cámara y establezca el nivel de cámara en 14 para visualizar los EV pequeños. Para iniciar la medición, haga clic en Crear y, a continuación, haga clic en Ejecutar script y seleccione la ubicación donde se deben guardar los archivos.
Introduzca los detalles necesarios de la muestra y haga clic en Aceptar. Haga clic en la configuración Aceptar para continuar con el script y haga clic en Aceptar para iniciar la medición. Una vez que se haya registrado la medición, analice los resultados con un umbral de detección de cinco para incluir de 10 a 100 cruces rojas por cuadro. Y el conteo de cruces azules se limita a cinco.
Haga clic en Configuración correcta para continuar con el script e iniciar el análisis. Haga clic en Aceptar en la notificación de finalización del script y exporte para exportar los datos a la ubicación establecida. Lise las pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano con tampón de lisis de ensayo de radioinmunoprecipitación helada e incube durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Recoja el sobrenadante después de centrifugar a 200 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Cuantificar la proteína mediante un ensayo de BCA. Ensamble el conjunto de electroforesis en gel en consecuencia y realice la electroforesis en gel a 90 voltios hasta que la proteína alcance el extremo del gel de apilamiento.
Cambie el voltaje a 200 voltios para separar las proteínas hasta el final del gel de resolución. Realice una transferencia semiseca para transferir las proteínas del gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno a 15 voltios durante una hora. Bloquear la membrana de PVDF con albúmina sérica bovina al 3% en solución salina tamponada con tris al 0,1% Tween 20 durante una hora en un agitador a temperatura ambiente.
Incubar la membrana de PVDF con anticuerpos primarios a cuatro grados centígrados durante la noche con agitación constante. Al día siguiente, lave la membrana de PVDF cinco veces y cinco minutos cada una con TBST e incube con un anticuerpo secundario durante una hora con agitación a temperatura ambiente. Una vez más, lave la membrana de PVDF con TBST cinco veces y visualice la membrana en un generador de imágenes de carga acoplada utilizando un reactivo de detección quimioluminiscente.
Analizar el nivel de expresión de las proteínas utilizando el software ImageJ. Primero, abra el archivo de imagen en ImageJ. Mejore la calidad de la imagen ajustando el brillo y el contraste.
Ajuste la imagen hasta que las manchas sean claramente visibles. Haga clic en el botón Aplicar y guarde las imágenes en formato TIFF. Para el análisis basado en microscopio electrónico de transmisión, diluir una parte de la muestra de pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano con cuatro partes de solución salina tamponada con fosfato filtrado hasta un volumen total de 10 microlitros e incubar en una rejilla de cobre recubierta de carbono durante 15 minutos.
Retire el exceso de muestra con una toallita de laboratorio y deje que se seque al aire durante tres minutos. Incubar 10 microlitros de solución de ácido fosfotúngstico al 1% para teñir la muestra durante tres minutos. Retire el exceso de solución de ácido fosfotúngstico al 1% con una toallita de laboratorio y deje que se seque al aire durante tres minutos para obtener imágenes bajo un microscopio electrónico de transmisión.
Las pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano tienen un modo de tamaño de partícula de 53 nanómetros, mientras que otros picos significativos de tamaño de partícula fueron de 96 y 115 nanómetros. La concentración de pequeñas vesículas extracelulares MSC derivadas del cordón umbilical humano medidas por NTA fue de 7,75 veces 10 a la décima partícula por mililitro. La concentración de proteínas de pequeñas vesículas extracelulares MSC derivadas del cordón umbilical humano medidas con el ensayo BCA fue de aproximadamente 80 microgramos por mililitro.
En el análisis western blotting, las vesículas extracelulares pequeñas MSC derivadas del cordón umbilical humano demostraron bandas positivas para los marcadores exosomales CD9, CD81 y TSG101, pero fueron negativas para GRP94. Las pequeñas vesículas extracelulares MSC aisladas derivadas del cordón umbilical humano se visualizaron bajo TEM para determinar su tamaño y morfología. Células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano pequeñas vesículas extracelulares de aproximadamente 100 nanómetros y mostraron una estructura de membrana bicapa en forma de copa.
Con el desarrollo exitoso del protocolo, ahora podemos descubrir los potenciales terapéuticos de las pequeñas vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales en medicinas regenerativas.
