זהו פרוטוקול פשוט ויעיל בזמן לבידוד וריכוז שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מתאי גזע מזנכימליים. טכניקה זו קלה לאימוץ ברוב המעבדות מכיוון שהיא בקנה מידה ודורשת רק מכשירים פשוטים לפעולות. כדי לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות, אנו ממליצים לגדל תאים בקנה מידה גדול כדי להשיג מינימום של מאה מיליון תאים.
למרות שזה נשמע פשוט, שלבים קריטיים מסוימים של טכניקה זו מושכלים טוב יותר באמצעות הדגמה חזותית. אנו מקווים שהחוקרים יוכלו ללמוד מניסיוננו ולשלוט במיומנויות בביטחון. תלמיד הדוקטורט שלנו, מר צ'אן, הונג האו, ידריך אותך דרך הניסיון שלנו בבידוד ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מתאי גזע מזנכימליים.
כדי להתחיל, צנטריפוגה את התווך המותנה ב 200 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאים. אספו וסננו את הסופרנאטנט דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים הגדולים מ-220 ננומטר. מילא יחידת מסנן צנטריפוגלית עם 30 מיליליטר של 0.2 מיקרומטר מסונן פוספט חוצץ מלוחים.
ואז צנטריפוגה את יחידת המסנן הצנטריפוגלי ב 3, 500 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את התמיסה לכוס תמיסת התסנין. הוסף 70 מיליליטר של תווך ממוזג מסונן ליחידת המסנן הצנטריפוגלי וצנטריפוגה את היחידה ב 3, 500 גרם בארבע מעלות צלזיוס.
יש להשליך את התמיסה לכוס תמיסת התסנין. מוסיפים 30 מיליליטר של מלח מסונן חוצץ פוספט וצנטריפוגה היחידה ב 3, 500 גרם בארבע מעלות צלזיוס. התקן איסוף מרוכז על יחידת המסנן וצנטריפוגה הפוכה ב 1, 000 גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל את השלפוחיות החוץ תאיות הקטנות מטוהרות.
סנן את השלפוחיות החוץ תאיות הקטנות דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. העבירו את הדגימות לצינורות חדשים ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס לניתוח נוסף. כדי להתחיל בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, דללו את תאי הגזע המזנכימליים המבודדים שמקורם בחבל הטבור האנושי בשלפוחיות חוץ-תאיות קטנות במי מלח מסוננים חוצצי פוספט ל-20 עד 100 חלקיקים לכל מסגרת.
הכניסו מיליליטר אחד של הדגימה המדוללת לתא האנטי-A באמצעות מזרקים חד פעמיים של מיליליטר. קבעו את הגדרות המדידה בהתאם. התאם את רמת המצלמה לרמה 14.
עבור כל מדידה, לחץ על המידה הסטנדרטית והגדר את הדילול בהתאם. לאחר מכן, לחץ על צלם, הפעל מצלמה והגדר את רמת המצלמה ל- 14 כדי להמחיש את כלי הרכב החשמליים הקטנים. כדי להתחיל את המדידה, לחץ/י על ״צור״ ולאחר מכן לחץ/י על ״הפעל סקריפט״ ובחר/י את המיקום שבו יש לשמור את הקבצים.
הזן את הפרטים הדרושים של המדגם ולחץ על אישור. לחצו על ההגדרה OK כדי להמשיך בסקריפט ולחצו על OK כדי להתחיל את המדידה. לאחר הקלטת המדידה, נתח את התוצאות עם סף זיהוי של חמישה כדי לכלול 10 עד 100 צלבים אדומים בכל מסגרת. וספירת הצלב הכחול מוגבלת לחמישה.
לחץ על הגדרת אישור כדי להמשיך את הסקריפט וליזום את הניתוח. לחץ על אישור בהודעת ההשלמה והייצוא של הסקריפט כדי לייצא את הנתונים למיקום שנקבע. ליז, תאי גזע מזנכימליים שמקורם בחבל הטבור האנושי, שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות עם משקעים רדיואימוניים קרים כקרח, לבדוק ליזיס חוצץ ולדגור במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאסוף את supernatant לאחר צנטריפוגה ב 200g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. כמת את החלבון באמצעות בדיקת BCA. הרכיבו את אלקטרופורזה הג'ל בהתאם ובצעו אלקטרופורזה בג'ל במתח של 90 וולט עד שהחלבון מגיע לקצה ג'ל הערימה.
שנה את המתח ל -200 וולט כדי להפריד את החלבונים עד סוף ג'ל הפתרון. בצע העברה חצי יבשה כדי להעביר את החלבונים מהג'ל לקרום פוליווינילידן דיפלואוריד ב 15 וולט למשך שעה אחת. חסמו את קרום PVDF עם אלבומין 3% בסרום בקר במי מלח חוצצים בתריס 0.1% Tween 20 למשך שעה על שייקר בטמפרטורת החדר.
לדגור על קרום PVDF עם נוגדנים ראשוניים בארבע מעלות צלזיוס במשך הלילה עם רעד מתמיד. למחרת, שטפו את קרום PVDF חמש פעמים וחמש דקות כל אחת עם TBST והמשיכו לדגור עם נוגדן משני למשך שעה אחת עם תסיסה בטמפרטורת החדר. שוב, שטפו את קרום PVDF עם TBST חמש פעמים ודמיינו את הממברנה במצלמת טעינה מצומדת באמצעות מגיב זיהוי כימילומינסנטי.
נתח את רמת הביטוי של החלבונים באמצעות תוכנת ImageJ. ראשית, פתח את קובץ התמונה ב- ImageJ. שפר את איכות התמונה על-ידי התאמת הבהירות והניגודיות.
התאימו את התמונה עד שהכתמים יהיו גלויים בבירור. לחץ על כפתור החל ושמור את התמונות בפורמט TIFF. לניתוח מבוסס מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, יש לדלל חלק אחד של דגימת תאי גזע מזנכימליים קטנים שמקורם בחבל הטבור האנושי בארבעה חלקים של מלח חוצץ פוספט מסונן לנפח כולל של 10 מיקרוליטר ולדגור על רשת נחושת מצופה פחמן למשך 15 דקות.
הוציאו את הדגימה העודפת באמצעות מגבון מעבדה והניחו לה להתייבש באוויר למשך שלוש דקות. לדגור 10 מיקרוליטר של 1% תמיסת חומצה phosphotungstic כדי להכתים את הדגימה במשך שלוש דקות. הסר את תמיסת החומצה הפוספוטונגסטית העודפת של 1% באמצעות מגבון מעבדה ואפשר לה להתייבש באוויר במשך שלוש דקות כדי לצלם אותה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת.
תאי גזע מזנכימליים שמקורם בחבל הטבור האנושי שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות הן בעלות מצב גודל חלקיקים של 53 ננומטר, בעוד שיאי גודל חלקיקים משמעותיים אחרים היו 96 ו-115 ננומטר. ריכוז החלקיקים החוץ-תאיים הקטנים MSC שמקורם בחבל הטבור שנמדד על ידי נת"ע היה פי 7.75 פי 10 עד העשירי למיליליטר. ריכוז החלבון של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות MSC שמקורן בחבל הטבור האנושי שנמדדו בבדיקת BCA היה כ-80 מיקרוגרם למיליליטר.
בניתוח כתמים מערביים, שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות MSC שמקורן בחבל הטבור האנושי הדגימו פסים חיוביים לסמנים אקסוזומליים CD9, CD81 ו-TSG101, אך היו שליליים עבור GRP94. השלפוחיות החוץ-תאיות הקטנות MSC שמקורן בחבל הטבור האנושי הודגמו תחת TEM כדי לקבוע את גודלן ואת המורפולוגיה שלהן. תאי גזע מזנכימליים שמקורם בחבל הטבור האנושי שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות בגודל של כ-100 ננומטר והראו מבנה קרום דו-שכבתי דמוי גביע.
עם הפיתוח המוצלח של הפרוטוקול, אנו יכולים כעת לחשוף את הפוטנציאל הטיפולי של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בשלפוחיות חוץ-תאיות קטנות בתרופות רגנרטיביות.
