يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في فهم الآليات المشاركة في تنظيم KCC2 من خلال التقييم المباشر لفسفرة الحجم الجزيئي للكيناز ، وبالتالي إلقاء الضوء على وظائفه وأنشطته الفسيولوجية. يمكن استخدامه لتحديد وتوصيف جزيئات مثل البروتينات ذات الأهمية من المخاليط المعقدة للجزيئات ذات الصلة حتى عندما يكون تعبير البروتين دقيقا جدا. هذه التقنية هي أداة أساسية لتحليل البروتين للأنظمة المعقدة وتحديد الآليات المحتملة الكامنة وراء وظيفة الأنسجة الشاذة أو المرض.
سيتم توضيح الإجراءات يوم الأحد سليمان يوشيا ، طالب دكتوراه من مختبري. ابدأ بالتسليح المسبق لجميع الكواشف في حمام حبة 37 درجة مئوية وإذابة خلايا الكلى الجنينية البشرية KCC2b المستقرة بالكامل في حمام الخرز. ثم نقل الخلايا من أنبوب قارورة التبريد إلى أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على خمسة ملليلتر من الوسائط الطازجة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 1،200 G لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.
بعد استنشاق المادة الطافية باستخدام ماصة شفاط مثبتة بمضخة تفريغ ، أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من الوسائط الطازجة. انقل المعلق إلى طبق 10 سم واتركه ينمو لمدة 48 ساعة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بمجرد أن تصل الخلايا إلى 90٪ من الالتقاء ، قم بتقسيمها عن طريق استنشاق الوسائط القديمة وشطفها بملليلتر من PBS.
أضف ملليلتر من التربسين واحتضنهما لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. اغسل خلايا التربسين باستخدام ملليلتر من الوسائط الكاملة. أضف تسعة ملليلتر من الوسائط الطازجة إلى الأطباق الجديدة.
ثم أضف ملليلتر واحد من المحلول من الطبق القديم إلى الطبق الجديد. انقل أطباق الخلية المنقسمة إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة لتحقيق أكثر من 90٪ من التقاء. عالج الخلايا إما باستخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد أو ثمانية ستوروسبورين ميكرومولار أو 0.5 مليمولار N-ethylmaleimide لمدة 15 دقيقة قبل الحصاد في محلول التحلل.
استنشاق الوسائط من طبق الثقافة المنقولة ، ووضع أطباق الثقافة على الجليد ، وغسل الخلايا مع PBS الجليد البارد. نضح PBS وإضافة 1.0 ملليلتر من عازلة تحلل الجليد البارد إلى الطبق. بعد كشط الخلايا من قاع الطبق باستخدام مكشطة خلية بلاستيكية باردة ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يوضع على الثلج ، يليه تحريض مستمر لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
بعد الطرد المركزي ، تحلل الخلية في جهاز طرد مركزي بارد ، ضعها على الجليد. اجمع المادة الطافية في أنبوب طازج مبرد مسبقا ، وتخلص من الحبيبات. ماصة 300 ميكرولتر من البروتين G Sepharose في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
ثم الطرد المركزي الحل في 500 غرام لمدة دقيقتين. بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف 500 ميكرولتر من PBS ودوامة جيدا. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي وكرر الخطوة.
بعد ذلك ، امزج ملليغرام واحد من الأجسام المضادة لثريونين KCC2 906 والأجسام المضادة لثريونين 1007 المضادة ل KCC2 مع 200 ميكرولتر من حبات Protein G Sepharose قبل تكوين الحجم إلى 500 ميكرولتر باستخدام PBS. بعد الاهتزاز على منصة تهتز أو عجلة دوارة لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية ، كرر غسلتين باستخدام PBS. قم بإجراء تقدير كمي للبروتين على محللات الخلية وأضف ملليغرام واحد من محللة الخلية إلى الخرز المغسول واحتضانه في دوار من طرف إلى طرف قبل الدوران.
أعط ثلاث غسلات مع PBS تحتوي على 150 ملليمولار كلوريد الصوديوم ، تليها ثلاث غسلات مع 200 ميكرولتر من PBS قبل إعادة تعليق الحبيبات النهائية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة LDS. هز الأنابيب في شاكر الدوار في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. احتضانها في كتلة تسخين وطرد مركزي قبل استخدام المادة الطافية لتحميل الهلام.
قم بتجميع جهاز صب Western Blot وصب جل فصل 8٪ طازج لصب الجل ، مما يتيح حوالي سنتيمترين من المساحة من أعلى زجاج الصب. أضف 200 ميكرولتر من الأيزوبروبانول المطلق إلى الإعداد واتركه يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة. قم بإزالة الأيزوبروبانول باستخدام ماصة وشطف الجل بعناية بحوالي 200 ميكرولتر من الماء المقطر.
بعد إضافة جل تكديس طازج بنسبة 6٪ إلى إعداد الصب ، قم بتركيبه برفق في مشط البئر واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم ثبت الجل المصبوب في خزان الرحلان الكهربائي. بعد صب المخزن المؤقت الجاري في الخزان ، قم بتحميل خمسة ميكرولتر من علامة الوزن الجزيئي في البئر الأول وكمية متساوية من البروتين في كل بئر من هلام SDS-PAGE.
املأ الآبار الفارغة ب LDS وقم بتشغيل الجل لمدة 90 إلى 120 دقيقة عند 120 فولت. إعادة ترطيب غشاء النيتروسليلوز مع نقل عازلة تحتوي على 20 ٪ من الميثانول. شطف الجل والغشاء مع المخزن المؤقت للنقل ونشرها برفق على كومة التحضير.
رتب الساندويتش المراد نقله بهذا الترتيب: قطب سالب ، رغوة شطيرة ، جل SDS-PAGE مغسول بورق الترشيح ، غشاء نيتروسليلوز مغسول ، ورق ترشيح ، رغوة شطيرة ، قطب موجب. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتكديس الساندويتش المجمع في خزان النقل وقم بتشغيله عند 90 فولت لمدة 90 دقيقة أو 30 فولت لمدة 360 دقيقة. سد الغشاء الجاف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام عازلة حجب.
احتضان الأغشية مع التخفيفات المناسبة من الأجسام المضادة الأولية وبيتا أكتين في منع العازلة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. ثم أعط ثلاث غسلات من TBST لمدة خمس دقائق لكل منهما. احتضان الغشاء المغسول بجسم مضاد ثانوي مخفف في مخزن مؤقت للحجب لمدة 60 دقيقة وكرر ثلاث غسلات من TBST.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، ضع الغشاء المغسول على لوحة التصوير. لتطوير الإشارات ، انشر المحلول المحضر عن طريق خلط أحجام متساوية من كل كاشف تلألؤ كيميائي محسن على الغشاء قبل نقل لوحة التصوير إلى نظام التصوير للتصوير. تسببت معالجة خلايا HEK293 باستخدام staurosporine و N-ethylmaleimide أو NEM في انخفاض الفسفرة في المواقع المستهدفة SPAK ، ثريونين 233 الموجود في مجال كيناز T-loop ، وموقع الفسفرة S-loop serine 373 من SPAK المعبر عنه داخليا.
قلل Staurosporine من فسفرة سيرين 940 في خلايا HEK294 التي تعبر بثبات عن KCC2b ، لكن NEM زادت بشكل كبير من الفسفرة. علاوة على ذلك ، يقلل الستوروسبورين من الفسفرة في موقع ثريونين 505 ، بينما تسبب NEM في زيادة طفيفة ولكنها غير مهمة في الفسفرة في نفس الموقع. ترتبط التأثيرات التفاضلية لكلا المركبين على فسفرة بروتين كيناز C في موقع ثريونين 505 و KCC2b في موقع سيرين 940 ارتباطا جيدا.
أظهرت النتيجة التمثيلية أيضا أن NEM تسبب في زيادة كبيرة في التعبير عن إجمالي كمية KCC2 ، في حين أن التعبير عن إجمالي NKCC1 و SPAK لم يتغير بشكل كبير عند معالجته بكلا المركبين. علاوة على ذلك ، تسبب المركبان في انخفاض فسفرة SPAK في مواقع ثريونين 233 وسيرين 373 ، وهذا مرتبط بالفسفرة المختصرة للثريونين 906/1007 والثريونين 203/207/212 والمعبر عنها داخليا NKCC1 على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، قلل ستوروسبورين و NEM من فسفرة بروتين كيناز C في موقع سيرين 940 وعبر بثبات عن KCC2b على التوالي ، والذي ارتبط بالتقليل والزيادة في فسفرة بروتين كيناز C دلتا في موقع ثريونين 505 عند معالجة الستوروسبورين و NEM على التوالي.
إذا تم استخدام جسم مضاد أولي أو ثانوي غير صحيح ، فلن يتم رؤية الشريط أثناء التصوير. أيضا ، قد لا تكون الإشارة مرئية إذا تم استخدام تركيز منخفض جدا من الأجسام المضادة. هذه التقنية هي أداة ذات صلة في التحليل الكمي للبروتين وقد سمحت باستخدامها للعديد من الأغراض العلمية والموارد ، بما في ذلك كأداة تشخيص مبكر فعالة.
