فلماذا هذا البروتوكول مهم؟ حسنا ، من الصعب جدا علاج نقائل الدماغ وينتج هذا البروتوكول نموذجا للفأر ذي الصلة سريريا مع الحد الأدنى من الأورام خارج الجمجمة. تسمح هذه التقنية بالتحليل الموضوعي لتوزيع الأدوية والاستجابة من الأورام داخل الجمجمة.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن النموذج قابل للتكرار بشكل كبير وأن نقائل الدماغ تتطور في وقت قصير نسبيا بعد الحقن. يتشابه تطور المرض بين الحيوانات ، مما يسهل على الباحثين توحيد التجارب والجداول الزمنية للعلاج ونقاط النهاية. نصيحتي للمبتدئين هي التدرب على استخدام الملقط والمحقنة أثناء النظر من خلال مجهر التشريح ، والتعرف على المعالم التشريحية حول الرقبة وممارسة البروتوكول بحضور طبيب بيطري.
ابدأ بزرع الخلايا السرطانية BT-474 بكثافة بذر تبلغ مرتين في 10 أس ست خلايا في دورق T-75 باستخدام 10 ملليلتر من وسائط النمو الكاملة والثقافة حتى تصل الخلايا إلى التقاء 70 إلى 80٪ قبل الحقن. في يوم الحقن ، تخلص من وسائط النمو واغسل الطبقة الأحادية للخلية باستخدام PBS مرتين وأضف خمسة ملليلتر من كاشف تفكك زراعة الخلايا قبل تسخينه. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق أو حتى تنفصل الخلايا.
بعد خمس دقائق ، أخرج القارورة من الحاضنة واضغط عليها برفق للمساعدة في انفصال الخلية. أضف خمسة ملليلتر من وسائط النمو الكاملة التي تحتوي على 10٪ FBS لإخماد نشاط كاشف التفكك. أعد تعليق الخلايا الموجودة في المحلول برفق عن طريق السحب لتقليل كتل الخلايا.
نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر وأجهزة الطرد المركزي في 180 غرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. صب المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من HBSSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم لتقليل تكتل الخلايا. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 180 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة صب المادة الطافية لإزالة المصل المتبقي أو كاشف التفكك وإعادة تعليق حبيبات الخلية في ثلاثة ملليلتر من HBSS.
ضع مصفاة خلوية سعة 100 ميكرومتر على أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر وقم بتمرير معلق الخلية لإزالة كتل الخلايا. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام التربان الأزرق وقم بتخفيف معلق الخلية باستخدام HBSS إلى تركيز خلية 2.5 في 10 أس ست خلايا لكل ملليلتر. حافظ على الأنبوب أفقيا على الجليد وهز الأنبوب برفق بشكل دوري لتقليل التكتل.
يمكن تخزين تعليق الخلية على الجليد لمدة أقصاها ست ساعات. فأر الأذن لكمة لتحديد واستخدام كليبرز الكهربائية لحلق الفراء من منطقة الرقبة. نظف الشعر الزائد من الجلد المكشوف باستخدام شريط لاصق.
ضع مادة تشحيم العين على العينين لمنع الجفاف. ثبت الماوس برفق عن طريق ربط الأسنان القاطعة العلوية باستخدام خيط مثبت على لوح الجراحة ، متبوعا بلصق الساقين الأمامية والخلفية. هذه الخطوة تمتد الجسم وتبقي الرقبة مستقيمة أثناء العملية.
لتحضير البشرة قبل الجراحة، امسح الرقبة بمطهر موضعي مثل بوفيدون اليود لتقليل حمل البكتيريا الدقيقة في الجلد وإزالة الشعر المتساقط. نظف من وسط الجلد ، واعمل للخارج لمنع إعادة تلوث موقع الشق. كرر العملية باستخدام 70٪ إيثانول وقم بإجراء ثلاث جولات متناوبة من اليود والإيثانول للتطهير.
تحقق من وجود رد فعل عبر اختبار القرص لضمان وفاة التخدير قبل متابعة الإجراء. وضع ستارة جراحية معقمة على الحيوان. تحت مجهر التشريح ، قم بعمل شق عمودي 15 ملم على طول خط الوسط في منطقة عنق الفأر باستخدام مقص ، بدءا من خمسة ملليمترات أسفل الفك إلى المدخل الصدري.
باستخدام زوجين من الملقط المائل ، قم بفصل الجلد والغدد اللعابية الكامنة وتطبيق المبعدات لإبقاء القصبة الهوائية مكشوفة. باستخدام زوجين من الملقط ذو الزاوية الدقيقة ، قم بتشريح العضلات والأنسجة الدهنية المجاورة للقصبة الهوائية بصراحة لكشف غمد الشريان السباتي الأيمن. الغمد السباتي هو الطبقة الليفية التي تغطي الشريان السباتي المشترك والوريد والعصب المبهم ، ويمكن تصور هذه الحزمة بواسطة الشريان السباتي المشترك الأحمر الفاتح.
قم بمسح جزء من الشريان السباتي الذيلي المشترك إلى التشعب السباتي للفافة المحيطة وفصله عن العصب المبهم والأوردة. عزل وإزالة التشعب السباتي من الأعصاب المحيطة واللفافة. ضع ملقط ناعم تحت الشريان السباتي الخارجي وقم بتمرير خياطة حريرية 5-0 تحت الشريان.
عقدة وتشديد خياطة وقطع الخط الزائد. ضع ملقط ناعم تحت الشريان السباتي المشترك وقم بتمرير خياطة حريرية 5-0 تحت الشريان. اربط عقدة وشد الخيط في موضع قريب من موقع الحقن المقترح.
قطع خياطة الزائدة ، وترك حوالي 10 ملليمتر من الخط. قم بقص وترطيب شريط من المساحات منخفضة الوبر التي تستخدم لمرة واحدة حوالي 10 × 5 ملم. قم بطي الشريط ووضعه تحت الشريان السباتي في موقع الحقن المقترح.
هذا سوف يدعم الوعاء أثناء الحقن. على منبر الشريان السباتي المشترك إلى موقع الحقن المقترح ، ضع ربطا ثالثا بعقدة فضفاضة. يتم تشديد هذا فقط بعد الحقن.
حرك معلق الخلية برفق وارسم 200 ميكرولتر من معلق الخلية في حقنة الأنسولين بإبرة قياس 31. قم بتحميل المحقنة في مشغل المحقنة المتصل بدواسة القدم المنشطة. قم بتوصيل قنية دقيقة بإبرة قياس 31 بالمحقنة وقم بتجهيز الخط.
تحقق مما إذا كان الشريان السباتي في وضع جيد ومضغوط. باستخدام ملقطين بزاوية دقيقة ، أحدهما يشد برفق على نهاية الرباط الأول والآخر يحمل إبرة قياس 31 ، أدخل الإبرة ببطء مع شطبة لأعلى في تجويف الوعاء الدموي ، مع الحرص على عدم ثقبها. حقن ببطء 100 ميكرولتر من تعليق الخلية أعدت في وقت سابق في الشريان السباتي المشترك في 10 ميكرولتر في الثانية.
سيؤدي ذلك إلى توصيل 2.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة في الوعاء الدموي. يمكن تصور الحقن الناجح عن طريق إزالة الدم من الأوعية الدموية السباتية. ارفع الرباط السائب وشده برفق فور سحب الإبرة لمنع التدفق العكسي والنزيف.
قم بقص الغرز الزائدة وإزالة قطعة المساحات المبللة منخفضة الوبر التي تستخدم لمرة واحدة. باستخدام ماصة P-200 ، اشطف التجويف الجراحي مرتين باستخدام 150 إلى 200 ميكرولتر من الماء المعقم أو المالحة. بعد التحقق من وجود نزيف ، أعد وضع الأنسجة الرخوة والغدد اللعابية والجلد فوق الشريان السباتي والقصبة الهوائية.
أغلق طبقة الجلد من الشق باستخدام حامل إبرة خياطة ، وملقط ، وخياطة حيدة 6-0 قابلة للامتصاص أو غير قابلة للامتصاص في نمط مستمر. حقن 50 ميكروغرام لكل كيلوغرام من البوبرينورفين وواحد ملليغرام لكل كيلوغرام من ميلوكسيكام عن طريق الحقن تحت الجلد لتخفيف الآلام بعد الجراحة. انقل الحيوان إلى قفص دافئ ونظيف للتعافي من التخدير.
تم حقن الليكتين في الشريان السباتي المشترك للفئران مع أو بدون ربط الشريان السباتي الخارجي. لوحظ انخفاض في الليكتين في أنسجة الخد عندما تم ربط الشريان السباتي الخارجي. أظهرت النتائج أن الربط لم يؤثر على توصيل الدماغ.
تمت مراقبة تطور الورم باستخدام خط خلايا سرطان الثدي المضخم HER2 المعبر عن اللوسيفراز. أظهر نموذج ورم خبيث في الدماغ BT474 زيادة في إشارات التوهج الحيوي من الأسبوع الخامس بعد الحقن السباتي الداخلي ونما تدريجيا بعد ذلك. من الأسابيع الخامسة إلى الثامنة ، أشارت شدة الإشارة غير المتجانسة إلى وجود ورم داخل الجمجمة مع نضح سائل معقد.
زاد تركيز الجادولينيوم داخل منطقة الورم حيث تسرب من الدورة الدموية إلى أنسجة الورم. تم تأكيد تراكم الطب النانوي ونقائل الدماغ في الفئران BT-474 من خلال مستويات الطب النانوي الأعلى المكتشفة في منطقة الورم مقارنة بمناطق الدماغ غير المعنية. مع تقدم نموذج ورم خبيث في الدماغ BT-474 ، بدأت الحيوانات تفقد ما يصل إلى 20٪ من وزن الجسم ، مما يجعل متوسط وقت البقاء على قيد الحياة بعد تسعة أسابيع من الحقن.
أظهرت نتائج الأنسجة أن الأورام كانت موجودة من جانب واحد ، مطابقة لموقع الحقن السباتي حيث ظهرت الأورام في الغالب ككتل صلبة انفرادية. لوحظت جيوب من المساحات الفارغة بشكل متكرر وتألفت من خلايا نخرية ، بينما كانت النواتج الأصغر موجودة أيضا في بعض الحيوانات. أهم شيء يجب تذكره عند محاولة البروتوكول هو إعداد الشريان السباتي ووضعه بشكل صحيح قبل إدخال الإبرة ، ثم تطبيق التوتر المناسب أثناء إدخال الإبرة.
هذا النموذج مفيد للباحثين الذين يستكشفون توصيل الدواء إلى الدماغ وفعالية العلاجات الجديدة لعلاج ورم خبيث في الدماغ.
