Так почему же этот протокол важен? Ну, метастазы в мозг очень сложно лечить, и этот протокол создает клинически значимую модель мыши с минимальными экстракраниальными опухолями. Этот метод позволяет объективно анализировать распределение лекарств и реакцию на внутричерепные опухоли.
Основным преимуществом этой методики является то, что модель обладает высокой воспроизводимостью и метастазы в мозг развиваются за относительно короткое время после инъекции. Прогрессирование заболевания аналогично среди животных, что облегчает исследователям стандартизацию экспериментов, сроков лечения и конечных точек. Мой совет для начинающих - практиковать использование щипца и шприца, глядя через рассеченный микроскоп, знакомясь с анатомическими ориентирами вокруг шеи и практикуя протокол в присутствии ветеринара.
Начните с посева раковых клеток BT-474 с плотностью посева в два раза от 10 до шести клеток в колбу T-75 с использованием 10 миллилитров полной питательной среды и культуры до тех пор, пока клетки не достигнут слияния от 70 до 80% перед инъекцией. В день инъекции отбросьте питательные среды и дважды промывайте клеточный монослой PBS и добавляйте пять миллилитров предварительно подогретого реагента диссоциации клеточной культуры. Насиживайте при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут или до тех пор, пока клетки не отделятся.
Через пять минут извлеките колбу из инкубатора и осторожно постучите по ней, чтобы помочь отслоению клеток. Добавьте пять миллилитров полной питательной среды, содержащей 10% FBS, чтобы погасить активность реагента диссоциации. Осторожно повторно суспендируйте клетки в растворе путем пипетирования, чтобы уменьшить клеточные сгустки.
Переложите клеточную суспензию в 50-миллилитровую трубку и центрифугу при 180 Г в течение трех минут при комнатной температуре. Декантируйте супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах HBSSS без кальция и магния, чтобы свести к минимуму слипание клеток. Центрифугируют клеточную суспензию при 180 Г в течение трех минут при комнатной температуре Декантируют супернатант для удаления остаточной сыворотки или диссоциационного реагента и повторно суспендируют клеточную гранулу в трех миллилитрах HBSS.
Поместите 100-микрометровый клеточный сетчатый фильтр на свежую 50-миллилитровую коническую трубку и пропустите клеточную суспензию, чтобы удалить сгустки клеток. Рассчитайте количество жизнеспособных клеток, используя трипан синий и разбавьте клеточную суспензию HBSS до концентрации клеток в 2,5 раза 10 до шести клеток на миллилитр. Держите трубку горизонтально на льду и осторожно периодически раскачивайте трубку, чтобы свести к минимуму слипание.
Клеточная суспензия может храниться на льду не более шести часов. Мышь для идентификации и использования электрических кусачек для бритья меха из области шеи. Очистите лишние волосы от открытой кожи с помощью ленты.
Нанесите глазную смазку на глаза, чтобы предотвратить пересыхание. Осторожно закрепите мышь, зацепив верхние резцовые зубы с помощью резьбы, приклеенной к хирургической доске, с последующим заклеиванием передних и задних ног. Этот шаг расширяет тело и держит шею прямой во время процедуры.
Для предоперационной подготовки кожи протрите шею местным антисептиком, таким как повидон йод, чтобы уменьшить нагрузку на микрофлору кожи и удалить распущенные волосы. Очищайте от центра кожи, действуя наружу, чтобы предотвратить повторное загрязнение места разреза. Повторите процесс с использованием 70% этанола и выполните три чередующихся раунда йода и этанола для дезинфекции.
Проверьте рефлекс с помощью теста на защемление, чтобы убедиться в смерти анестезии перед продолжением процедуры. Положите на животное стерильную хирургическую драпировку. Под рассеченным микроскопом сделайте вертикальный 15-миллиметровый разрез вдоль средней линии в области шеи мыши с помощью ножниц, начиная от пяти миллиметров ниже челюсти до грудного входа.
Используя две пары угловых щипцов, разделите кожу и подлежащие слюнные железы и нанесите ретракторы, чтобы держать трахею открытой. Используя две пары тонкоугольных щипцов, тупо рассекают мышечную и жировую ткань, прилегающую к трахее, чтобы обнажить правую сонную оболочку. Сонная оболочка представляет собой фиброзный слой, покрывающий общую сонную артерию, вену и блуждающий нерв, и этот пучок можно визуализировать ярко-красной общей сонной артерией.
Очистите сегмент общей сонной артерии каудально до каротидной бифуркации окружающей фасции и отделите ее от блуждающего нерва и вен. Изолируют и очищают бифуркацию сонной артерии от окружающих нервов и фасций. Расположите тонкие щипцы под наружной сонной артерией и проведите 5-0 шелковым швом под артерией.
Завяжите узел и затяните шов и отрежьте лишнюю линию. Расположите тонкие щипцы под общей сонной артерией и проведите 5-0 шелковым швом под артерией. Завяжите узел и затяните шов в положении, близком к предполагаемому месту инъекции.
Отрежьте лишний шов, оставив около 10 миллиметров линии. Вырежьте и смочите полоску низковорсовых одноразовых дворников размером около 10 на 5 миллиметров. Сложите полоску и поместите ее под сонную артерию в предполагаемом месте инъекции.
Это будет поддерживать сосуд во время инъекции. На ростральную общую сонную артерию к предполагаемому месту инъекции поместить третью перевязку со рыхлым узлом. Это затягивается только после инъекции.
Осторожно перемешайте клеточную суспензию и втяните 200 микролитров клеточной суспензии в инсулиновый шприц с помощью иглы 31-го калибра. Загрузите шприц в драйвер шприца, подключенный к активирующей ножной педали. Прикрепите тонкую канюлю с иглой 31 калибра к шприцу и загрунтуйте линию.
Проверьте, хорошо ли расположена сонная артерия и находится под давлением. Используя два тонкоугольных щипца, один из которых мягко натягивается на конец первой лигатуры, а другой удерживает иглу 31-го калибра, медленно вставьте иглу со скосом вверх в просвет кровеносного сосуда, следя за тем, чтобы не проколоть его. Медленно вводят 100 микролитров клеточной суспензии, приготовленной ранее, в общую сонную артерию со скоростью 10 микролитров в секунду.
Это доставит 2,5 раза по 10 к пятой клетке в кровеносный сосуд. Успешная инъекция может быть визуализирована путем очистки крови из сонного кровеносного сосуда. Осторожно поднимите и затяните свободную лигатуру сразу после извлечения иглы, чтобы предотвратить обратный поток и кровотечение.
Обрежьте лишние швы и извлеките кусок увлажненных низковорсовых одноразовых дворников. Используя пипетку P-200, дважды промойте хирургическую полость 150-200 микролитрами стерильной воды или физиологического раствора. После проверки кровотечений переместите мягкие ткани, слюнные железы и кожу над сонной артерией и трахеей.
Закройте кожный слой разреза с помощью шовного иглы-держателя, щипцов и рассасывающегося или нерассасывающегося монофиламентного шва 6-0 в непрерывном режиме. Инъекция 50 микрограмм на килограмм бупренорфина и один миллиграмм на килограмм мелоксикама через подкожную инъекцию в качестве послеоперационного обезболивания. Переместите животное в теплую и чистую клетку, чтобы восстановиться после анестезии.
Лектин вводили в общую сонную артерию мышей с перевязкой наружной сонной артерии или без нее. Снижение лектина наблюдалось в тканях щек при перевязке наружной сонной артерии. Результаты показали, что лигирование не повлияло на доставку мозга.
Прогрессирование опухоли контролировали с использованием люцифераз-экспрессирующей, HER2-амплифицированной клеточной линии рака молочной железы. Модель метастазирования BT474 в мозг показала увеличение биолюминесцентных сигналов с пятой недели после внутренней инъекции сонной артерии и постепенно росла после этого. С пятой по восемь недель гетерогенная интенсивность сигнала указывала на внутричерепную опухоль со сложной перфузией жидкости.
Концентрация гадолиния в области опухоли увеличивалась по мере его утечки из кровообращения в опухолевую ткань. Накопление наномедицины и метастазов в мозг было подтверждено у мышей BT-474 более высокими уровнями наномедицины, обнаруженными в области опухоли по сравнению с невовлеченными областями мозга. По мере прогрессирования модели метастазирования в мозг BT-474 животные начали терять до 20% массы тела, что делало среднее время выживания девять недель после инъекции.
Результаты гистологии показали, что опухоли были расположены в одностороннем порядке, что соответствует месту инъекции сонной артерии, где опухоли в основном выглядели как твердые, одиночные массы. Карманы пустых пространств часто наблюдались и состояли из некротических клеток, в то время как более мелкие выросты также присутствовали у некоторых животных. Самое главное, что нужно помнить при попытке протокола, это правильно подготовить и расположить сонную артерию перед введением иглы, а затем применить надлежащее натяжение во время введения иглы.
Эта модель полезна для исследователей, изучающих доставку лекарств в мозг и эффективность новых терапевтических средств для лечения метастазов в мозг.
