では、なぜこのプロトコルが重要なのでしょうか。さて、脳転移は治療が非常に困難であり、このプロトコルは、頭蓋外腫瘍が最小限の臨床的に関連するマウスモデルを生成します。この技術により、頭蓋内腫瘍からの薬物分布と反応を客観的に分析できます。
この技術の主な利点は、モデルが再現性が高く、注射後比較的短時間で脳転移が発生することです。病気の進行は動物間で類似しているため、研究者は実験、治療のタイムライン、およびエンドポイントを簡単に標準化できます。初心者への私のアドバイスは、解剖顕微鏡を覗きながら鉗子と注射器の使用を練習し、首の周りの解剖学的ランドマークに慣れ、獣医の前でプロトコルを練習することです。
まず、BT-474がん細胞を10ミリリットルの完全増殖培地を使用してT-75フラスコに10倍の2倍の播種密度で播種し、細胞が注入前に70〜80%のコンフルエンシーに達するまで培養します。注射当日、増殖培地を廃棄し、細胞単層をPBSで2回洗浄し、5ミリリットルの予め温めた細胞培養解離試薬を加える。摂氏37度で5分間、または細胞が剥離するまでインキュベートします。
5分後、フラスコをインキュベーターから取り出し、細胞剥離を助けるためにそっと軽くたたきます。10%FBSを含む5ミリリットルの完全増殖培地を添加して、解離試薬活性を消光します。ピペッティングにより溶液中の細胞を穏やかに再懸濁し、細胞の凝集を減らします。
細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに移し、室温で3分間180Gで遠心分離する。上清をデカントし、細胞ペレットをカルシウムとマグネシウムを含まない10ミリリットルのHBSSSに再懸濁して、細胞の凝集を最小限に抑えます。細胞懸濁液を180 Gで室温で3分間遠心分離し、上清をデカントして残留血清または解離試薬を除去し、細胞ペレットを3ミリリットルのHBSSに再懸濁します。
100マイクロメートルのセルストレーナーを新しい50ミリリットルのコニカルチューブに置き、セル懸濁液を通過させてセルの塊を取り除きます。トリパンブルーを使用して生細胞数を計算し、HBSSで細胞懸濁液を10〜6細胞/ミリリットルの2.5倍の細胞濃度に希釈します。チューブを氷上で水平に保ち、凝集を最小限に抑えるために定期的にチューブを静かに揺り動かします。
細胞懸濁液は、最大6時間氷上に保存することができる。識別のための耳穿刺マウスと首の領域から毛皮を剃るために電気バリカンを使用します。露出した皮膚から余分な髪をテープできれいにします。
乾燥を防ぐために眼の潤滑剤を目に塗ります。外科用ボードにテープで留めた糸を使用して上顎切歯を引っ掛け、続いて前脚と後脚をテーピングして、マウスを優しく固定します。このステップは、体を伸ばし、手術中に首をまっすぐに保ちます。
術前の皮膚の準備のために、ポビドンヨードなどの局所消毒剤で首を拭いて、皮膚の微生物叢の負荷を減らし、抜け毛を取り除きます。皮膚の中心からきれいにし、切開部位の再汚染を防ぐために外側に働きます。70%エタノールを使用してこのプロセスを繰り返し、消毒のためにヨウ素とエタノールを交互に3回行います。
手順を続行する前に、ピンチテストで反射をチェックして、麻酔による死亡を確認してください。動物の上に滅菌外科用ドレープを置きます。解剖顕微鏡下で、顎下5ミリメートルから胸部入口まで、ハサミを使用してマウスの首領域の正中線に沿って垂直に15ミリメートルの切開を行います。
2対の角度の付いた鉗子を使用して、皮膚とその下にある唾液腺を分け、気管を露出させ続けるために開創器を適用します。2対の細かい角度の鉗子を使用して、気管に隣接する筋肉と脂肪組織を鈍く解剖し、右頸動脈鞘を露出させます。頸動脈鞘は、総頸動脈、静脈、迷走神経を覆う線維層であり、この束は真っ赤な総頸動脈によって視覚化できます。
周囲の筋膜の頸動脈分岐部までの総頸動脈の尾部の一部を取り除き、迷走神経および静脈から分離します。頸動脈分岐部を周囲の神経や筋膜から隔離して取り除きます。細かい鉗子を外頸動脈の下に配置して、動脈の下に5-0の絹縫合糸を通過させます。
縫合糸を結びつけて締め、余分な線を切ります。総頸動脈の下に細かい鉗子を配置し、動脈の下に5-0の絹縫合糸を通過させます。結び目を結び、提案された注射部位の近位位置で縫合糸を締めます。
余分な縫合糸を切り取り、約10ミリメートルの線を残します。糸くずの少ない使い捨てワイパーのストリップを約10 x 5ミリメートルカットして湿らせます。ストリップを折り、注射の提案された部位の頸動脈の下に置きます。
これは注入中に血管を支えます。提案された注射部位への総頸動脈吻側に、緩い結び目で3番目の結紮を置きます。これは注射後にのみ締め付けられます。
細胞懸濁液を穏やかに攪拌し、200マイクロリットルの細胞懸濁液を31ゲージの針を備えたインスリン注射器に引き込みます。作動するフットペダルに接続されたシリンジドライバーにシリンジをロードします。31ゲージの針が付いた細かいカニューレをシリンジに取り付け、ラインをプライミングします。
頸動脈が適切に配置され、加圧されているかどうかを確認します。2つの細かい角度の鉗子を使用して、1つは最初の結紮糸の端にそっと引っ張り、もう1つは31ゲージの針を保持し、ベベルを上にして針を血管の内腔にゆっくりと挿入し、穴を開けないように注意します。先に調製した100マイクロリットルの細胞懸濁液を毎秒10マイクロリットルで総頸動脈にゆっくりと注入します。
これにより、10の2.5倍の5番目の細胞が血管に送り込まれます。注射の成功は、頸動脈血管からの血液の除去によって視覚化することができます。針を抜いた直後に緩んだ結紮糸をそっと持ち上げて締め、逆流や出血を防ぎます。
余分な縫合糸を切り取り、湿らせた糸くずの少ない使い捨てワイパーを取り除きます。P-200ピペットを使用して、150〜200マイクロリットルの滅菌水または生理食塩水で手術腔を2回すすぎます。出血をチェックした後、軟部組織、唾液腺、および皮膚を頸動脈と気管の上に再配置します。
縫合針ホルダー、鉗子、および吸収性または非吸収性の6−0モノフィラメント縫合糸を連続パターンで使用して切開部の皮膚層を閉じる。術後の痛みの緩和として、ブプレノルフィン1キログラムあたり50マイクログラム、メロキシカム1キログラムあたり1ミリグラムを皮下注射で注射します。.麻酔から回復するために動物を暖かく清潔なケージに移動します。
レクチンは、外頸動脈結紮の有無にかかわらず、マウスの総頸動脈に注射されました。外頸動脈を結紮すると頬部組織にレクチンの減少が認められた。結果は、結紮が脳送達に影響を与えなかったことを示しました。
腫瘍の進行は、ルシフェラーゼ発現HER2増幅乳癌細胞株を用いてモニターした。BT474脳転移モデルは、内頸動脈注射後5週目から生物発光シグナルの増加を示し、その後徐々に成長しました。5週目から8週目にかけて、不均一なシグナル強度は、複雑な体液灌流を伴う頭蓋内腫瘍を示しました。
腫瘍領域内のガドリニウム濃度は、血液循環から腫瘍組織に漏出するにつれて増加した。ナノメディシンおよび脳転移の蓄積は、関与していない脳領域と比較して腫瘍領域で検出されたより高いナノメディシンレベルによってBT-474マウスで確認された。BT-474脳転移モデルが進行するにつれて、動物は最大20%体重を失い始め、生存期間の中央値は注射後9週間になりました。
組織学の結果、腫瘍は一方的に位置し、腫瘍が主に固体の孤立した腫瘤として現れた頸動脈注射部位と一致していることが示されました。空きスペースのポケットが頻繁に観察され、壊死細胞で構成されていましたが、一部の動物では小さな成長も存在していました。プロトコルを試みる際に覚えておくべき最も重要なことは、針を挿入する前に頸動脈を正しく準備して配置し、針の挿入中に適切な張力をかけることです。
このモデルは、脳への薬物送達と脳転移の治療のための新しい治療法の有効性を探求する研究者にとって有用です。
