يسمح البروتوكول الموصوف بتحليل النمط الظاهري للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم في نخاع العظم والخلايا اللحمية لنخاع العظم. يمكن استخدامه لدراسة الاضطرابات لهؤلاء السكان في بيئات مختلفة. بالمقارنة مع الطرق الأخرى الموصوفة سابقا ، تسمح هذه التقنية بتحليل النمط الظاهري للخلايا المكونة للدم ، وتحديدا في منطقتي النخاع الوظيفيتين ، النخاع الباطني ونخاع العظم المركزي ، وكذلك الخلايا اللحمية لنخاع العظم.
للبدء ، ضع الحيوان الرحيم مع البطن على طبق بتري ورشه بنسبة 70٪ إيثانول. قم بعمل قطع فوق البطن باستخدام المقص واسحب الجلد بعيدا حتى الكاحلين. الاستيلاء على واحدة من الساقين وقطع في قاعها لفصلها عن الحيوان باستخدام مقص.
ثم قم بإزالة القدم من الساق عن طريق قطع الكاحل ووضع الساق في الثلج البارد PBS 2٪ FBS. بعد ذلك ، أمسك عظم الورك باستخدام ملاقط واقطعه خلفه لفصله عن الحيوان باستخدام المقص. ضع عظم الورك في الثلج البارد PBS 2٪ FBS.
بعد وضع عظم الساق والورك في طبق بتري ، قم بتنظيف العظام باستخدام مشرط معقم. ثم افصل الساق وعظم الفخذ عن طريق قطع الركبة بالمشرط وضع العظام النظيفة في الثلج البارد PBS 2٪ FBS. ضع عظم الفخذ أو الساق في هاون مع الثلج البارد PBS 2٪ FBS وسحق العظم عن طريق الضغط عليه برفق على جدار الهاون باستخدام المدقة.
بعد ذلك ، ماصة تعليق الخلية الناتجة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 10 ملليلتر لتجانسها ونقلها إلى أنبوب 50 ملليلتر من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر موضوعة أعلى الأنبوب. شطف هاون مع بعض أكثر PBS 2٪ FBS ونقل الحل إلى نفس أنبوب 50 ملليلتر من خلال نفس مصفاة الخلايا 40 ميكرومتر. جهاز طرد مركزي أنبوب 50 ملليلتر عند 500 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من محلول تحلل كرات الدم الحمراء في درجة حرارة الغرفة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات. بعد حضانة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، أضف 15 ملليلترا من PBS 2٪ FBS وأجهزة الطرد المركزي أنبوب 50 ملليلتر. إذا كانت حبيبات الخلية لا تبدو حمراء ، فتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS وانقل تعليق الخلية إلى بئر صفيحة سفلية بطول 96 بئرا على شكل حرف V للتلطيخ.
بعد سحق العظم كما هو موضح سابقا ، قم بقطع طرف ماصة P1000 باستخدام المقص واستخدمه لنقل كل محتوى الهاون إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر. ثم الطرد المركزي أنبوب 50 ملليلتر في 500 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في ثلاثة ملليلتر من كولاجيناز IV ومحلول dispase-II هذا.
احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. قم بتعبئة الأنبوب إلى 25 ملليلتر باستخدام PBS 2٪ FBS ودوامة للخلط. بعد ذلك ، انقل المحتوى إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر.
ثم أضف 15 ملليلتر من PBS 2٪ FBS إلى الأنبوب القديم سعة 50 ملليلتر وانقل المحلول إلى أنبوب 50 ملليلتر الجديد من خلال مصفاة الخلايا 100 ميكرومتر. بعد الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من محلول تحلل كرات الدم الحمراء عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام ماصة. بعد الحضانة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، أضف 15 ملليلترا من PBS 2٪ FBS.
مرة أخرى ، قم بطرد الأنبوب وإذا كانت حبيبات الخلية لا تبدو حمراء بعد التخلص من المادة الطافية ، فأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS وانقل تعليق الخلية إلى بئر من الصفيحة السفلية V 96 بئرا للتلطيخ. ثم أجهزة الطرد المركزي لوحة في 500 غرام لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية. ضع عظم الفخذ على طبق بتري وقطع أطراف العظم باستخدام مشرط معقم.
ثم اغسل الجزء المركزي من العظم عن طريق تمرير 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS عبر داخل العظم مرة واحدة من كل جانب باستخدام حقنة أنسولين 0.5 ملليلتر بدون حجم ميت وجمع المحلول في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على ملليلتر واحد من PBS 2٪ FBS. بعد ذلك ، قم بنقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر يسمى نخاع العظم المتدفق الذي يحتوي على أربعة ملليلتر من PBS 2٪ FBS. سحق نهايات العظم في هاون مع الثلج البارد PBS 2٪ FBS عن طريق الضغط عليها برفق على جدار الهاون باستخدام المدقة.
بمجرد تجانس معلق الخلية ، انقله إلى أنبوب سعة 50 ملليلترا يسمى نخاع العظم المسحوق من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. أخيرا ، اشطف الهاون ببعض PBS 2٪ FBS وانقل المحلول إلى نفس الأنبوب. تم إجراء تحليل التدفق الخلوي للخلايا الجذعية المكونة للدم والأسلاف متعددة القدرات في نخاع العظم الكلي في فأر C57BL6J الشاب الأصحاء.
في تحليل الخلايا اللحمية والخلايا البطانية والخلايا الجذعية الوسيطة في نخاع العظم الكلي ، يمكن التعرف بسهولة على الخلايا الجذعية الوسيطة بناء على تعبير مستقبلات اللبتين ويمكن تحديد الخلايا البطانية بناء على تعبير CD31 و SCA-1. تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا البطانية في نخاع العظم الكلي الذي يظهر التمييز بين الخلايا البطانية الشريانية والجيبية بناء على ICAM1. يظهر القياس الكمي للخلايا البطانية لنخاع العظم الشرياني والجيبي في أنسجة نخاع العظم المركزية والداخلية أن الخلايا البطانية لنخاع العظم الشرياني أكثر وفرة في المناطق الداخلية ، في حين أن الجيوب الأنفية أكثر تواترا في مناطق نخاع العظم المركزي.
عند الحصول على نخاع العظم المحمر ، يجب عدم تجاوز حجم أو عدد المرات المشار إليها لتمرير PBS 2٪ FBS عبر الجزء الداخلي من الجزء المركزي من العظم. إن الجمع بين الطريقة الموصوفة والمقايسات الوظيفية لمجموعات الخلايا التي تم تحليلها ظاهريا من شأنه أن يوفر مزيدا من المعلومات القيمة حول الاضطرابات المحتملة لهذه المجموعات التي تحدث في الظروف المدروسة. يسمح البروتوكول الموصوف بتحليل النمط الظاهري للخلايا المكونة للدم بشكل تفاضلي في النخاع العظمي الداخلي ونخاع العظم المركزي ، مما يمكن الباحثين من التحقيق في الاضطرابات في المكونة للدم التي يحتمل أن تحدث على وجه التحديد في مواقع نخاع العظم هذه.
