التغيرات الأيضية في الخلايا الجذعية والنسلية للدم تسمح لهم بالانتقال من حالتها هادئة إلى حالة تمايز للحفاظ على مطالب تكوين الدم. يؤدي التغيير في اللدونة الأيضية في الخلايا الجذعية والنسلية للدم إلى اضطرابات الدم. سوف يساعد بروتوكولنا على قياس تنظيم التمثيل الغذائي وصحة الخلايا الجذعية والنسلية للدم أثناء تطور الدم والأمراض.
تحليل التنفس الميتوكوندريا وتحلل الخلايا الجذعية والنسلية في الدم أمر صعب لأنها سكان هشة ونادرة. يسمح بروتوكولنا الأمثل بعزل كمية أكبر من الخلايا الجذعية والنسلية للدم من نخاع العظم المورين ، ويحسن من قابليتها للحياة أثناء الحضانة ، ويسهل تحليل التدفق خارج الخلية من HSPCs غير المنضمة ، ويوفر معلمات حقن محسنة للمخدرات التي تستهدف الفوسفور التأكسي بالإضافة إلى مسارات الغليوليكية. لبدء هذا الإجراء، ملء آبار لوحة المرافق والغرف حول الآبار بالماء المعقم.
غمر خرطوشة الاستشعار في لوحة المرافق مع التأكد من أن أجهزة الاستشعار مغطاة بالكامل بالماء. ثم ضع الخراطيش المغمورة في لوحة المرافق في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لاحتضانها بين عشية وضحاها. في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية، إضافة 40 ميكرولترات من 0.1٪ المتاحة تجاريا حل PLL إلى كل بئر من لوحة المقايسة.
غطي لوحة المقايسة بالغطاء المقدم في الطقم ويحضن اللوحة المغلقة في درجة حرارة الغرفة تحت غطاء محرك السيارة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، استخدم جهاز pirator معقم قائم على الفراغ لإزالة الحل الزائد والهواء يجف الصفيحة تحت غطاء محرك السيارة. لحصاد خلايا نخاع العظام المورين أحادية النواة، أضف خمسة ملليلترات من متوسط الكثافة الانحداري إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
إضافة ببطء خمسة ملليلتر من تعليق خلية نخاع العظم التأكد من أن الخلايا تبقى كطبقة فوق متوسط التدرج الكثافة. أجهزة الطرد المركزي في 500 مرة ز وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة التأكد من أن الطرد المركزي هو في أدنى تسارع ممكن. حصاد واجهة الأوسط من الخلايا أحادية النوى في أنبوب 15 ملليلتر الطازجة.
ثم غسل الخلايا مع خمسة ملليلتر من 1X PBS تحتوي على 2٪ FBS. أجهزة الطرد المركزي في 500 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. إزالة عظمى وإعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولترات من 1X برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FBS.
بعد ذلك، aliquot 10 ميكرولترات من تعليق الخلية للتحكم غير الملطخة أو أحادية اللون في أنبوب FACS. لحصاد HSPCs LSK من خلايا نخاع العظام أحادية النواة، أضف 15 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة الحيوية إلى 300 ميكرولترات من خلايا نخاع العظام أحادية النوي. لحصاد HSPCs LSK من خلايا نخاع العظام أحادية النواة، أضف 15 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة الحيوية إلى 300 ميكرولترات من خلايا نخاع العظام أحادية النوي.
ضع الأنابيب في دلو ثلج وضع على شاكر في ثلاجة لاحتضان أربع درجات مئوية مع التحريض لمدة 30 دقيقة. ثم إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1X المبردة مسبقاً تحتوي على 2٪ FBS إلى الخلايا. أجهزة الطرد المركزي في 500 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
تجاهل السوبر و resuspend بيليه الخلية في 400 ميكرولترات من 1X برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FBS. لفترة وجيزة دوامة الميكروبات المضادة للبيوتين قبل الاستخدام. إضافة 80 ميكرولترات من الميكروبات إلى كل عينة ويخلط جيدا.
احتضان لمدة 20 دقيقة إضافية في أربع درجات مئوية مع الهياج. بعد هذا، إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني ما قبل المبردة التي تحتوي على 2٪ FBS إلى الخلايا. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 500 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
تجاهل عظمى و resuspend بيليه الخلية في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FBS. تخزين تعليق الخلية في أربع درجات مئوية أثناء إعداد وحدة الفصل المغناطيسي. ضع العمود في حقل مغناطيسي لفاصل فرز الخلايا المغناطيسية المساعدة عند أربع درجات مئوية.
إعداد العمود للفصل المغناطيسي عن طريق شطفه مع ثلاثة ملليلترات من 1X PBS تحتوي على 2٪ FBS تحت تدفق الجاذبية عند أربع درجات مئوية. أضف تعليق الخلية إلى العمود قبل الرطب عند أربع درجات مئوية. السماح لجميع الخلايا بالمرور من خلال العمود في أربع درجات مئوية وجمع النفايات السائلة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
بعد ذلك، قم بغسل العمود بثلاثة ملليلترات من PBS 1X و2٪ FBS عند أربع درجات مئوية. كرر هذا الغسيل ثلاث مرات. جمع تدفق من خلال والحفاظ عليه في أربع درجات مئوية.
جهاز طرد مركزي الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على تدفق من خلال في 500 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل عظمى و resuspend الخلايا في 0.5 ملليلتر من 1X PBS مع 2٪ FBS ونقل التعليق إلى أنبوب FACS. ثم إضافة 24 ميكرولترات من كوكتيل LSK الأجسام المضادة لكل 10 مليون خلية.
تغطية أنبوب مع احباط واحتضان في الظلام في أربع درجات مئوية مع الانفعال لمدة ساعة واحدة. بعد هذا، إضافة ثلاثة ملليلتر من 1X PBS مع 2٪ FBS إلى أنبوب FACS. أجهزة الطرد المركزي في 500 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
تجاهل السوبر و resuspend الخلايا التي تحمل علامات الأجسام المضادة في ملليلتر واحد من 1 × PBS تحتوي على 2 ٪ FBS. فقط قبل الفرز، إضافة ميكرولتر واحد من ملليغرام واحد لكل المليلتر بروديوميد إلى تعليق الخلية واستخدام مصفاة 40 ميكرومتر لتصفية محتويات أنبوب FACS. أولاً، الطرد المركزي الخلايا LSK التي تم جمعها في 500 مرة ز وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
تجاهل السوبر و resuspend الخلايا في وسائل الإعلام الكاملة إلى تركيز النهائي لا يقل عن 70،000 الخلايا في 40 ميكرولترات. البذور 40 microliters من هذا التعليق الخلية في آبار لوحة PLL المغلفة ثمانية جيدا التأكد من ترك كل من الآبار الزاوية فارغة. جهاز طرد مركزي في لوحة 450 مرات ز وفي درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
استخدم مجهر مقلوب لضمان توصيل الخلايا إلى قاع الآبار. بعد هذا، إضافة 135 microliters من وسائل الإعلام كاملة للخلايا في كل بئر جلب الحجم النهائي لكل بئر إلى 175 ميكرولترات. إضافة 175 microliters من وسائل الإعلام كاملة إلى اثنين من زوايا لوحة كفراغات.
احتضان الخلايا في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. ثم قم بإعداد برنامج للمحلل لإضافة الأدوية إلى كل بئر من الآبار على النحو المبين في الجدول الثاني والجدول الثالث من بروتوكول النص. لاختبار الإجهاد الميتوكوندريا، استرداد خرطوشة الاستشعار في لوحة فائدة من الحاضنة بحيث كل بئر لديه تركيز نهائي من اثنين من أليجوميسين ميكرومولار، 1.5 FCCP ميكرومولار، و 0.5 ميكرومولار من أي روفينون ومكافحة الميسين A حسب الحاجة.
قم بإزالة الغطاء من خرطوشة المستشعرات وضعه على علبة الأدوات. بدء عملية المعايرة التي سوف تستغرق 20 دقيقة. عند اكتمال المعايرة، قم بإزالة لوحة الأدوات المساعدة وأستبدلها بلوحة المقايسة التي تحتوي على خلايا LSK.
اضغط على متابعة لبدء تشغيل البرنامج الذي تم تعيينه مسبقاً. عند اكتمال البرنامج، استرداد البيانات وتحليلها. في هذه الدراسة، يتم عزل الحد الأقصى للمبلغ القابل للحياة من مورين LSK HSPCs ويتم قياس تحللها والتمثيل الغذائي الميتوكوندريا مع محلل تدفق خارج الخلية.
على الرغم من أن تحليل تدفق خارج الخلية يستخدم تقليديا للخلايا المنضمة، وهذا الأسلوب يجعل HSPCs LSK تُلتصَق بالآبار المغلفة PLL التي تسمح بقياس التدفق خارج الخلية وبالتالي الصحة الأيضية لـ HSPCs LSK. من أجل قياس التنفس الميتوكوندريا من خلال معدل استهلاك الأكسجين وتحلل من خلال معدل التحمض خارج الخلية في ظروف القاعدية والإجهاد ، يتم حقن الأدوية التي تتداخل مع تحلل التحلل والتنفس الميتوكوندريا بالتتابع. كما هو متوقع، فإن المستوى القاعدي لمعدل التحمض خارج الخلية أعلى بالنسبة لـ LSK HSPCs المستزرعة في الجلوكوز وبايروفات الوسائط الإيجابية مقارنة بتلك التي يتم استزراعها في الوسائط السلبية.
لم يغير الحقن مع الجلوكوز معدل التحمض خارج الخلية للخلايا المستزرعة في الوسائط الإيجابية ، ولكنه عزز تحلل الخلايا في الوسائط السلبية. ومع ذلك، فإن المستوى القاعدي لهذه الخلايا لا يزال أقل في المجموعة الإيجابية. حقن مع oligomycin تنشيط تحلل في أقصى مستوى لها في المجموعة الإيجابية، ولكن لم يؤثر على المجموعة السلبية.
حقن مع التناظرية الجلوكوز في 2-DG عاد معدل التحمض خارج الخلية إلى مستويات غير glycolytic. بالنسبة لاختبار الإجهاد الميتوكوندريا، حقن أولغوميسين فرط القطب غشاء الميتوكوندريا منع ضخ المزيد من البروتون من خلال مجمعات ETC وبالتالي تقليل معدل التنفس الميتوكوندريا. حقن FCCP يدفع معدل استهلاك الأكسجين إلى الحد الأقصى كما الخلايا في محاولة لاستعادة إمكانات غشاء الميتوكوندريا.
الحقن مع اثنين من مثبطات سلسلة نقل الإلكترونات الأخرى يسبب التنفس الميتوكوندريا لوقف تماما وبالتالي فإن معدل استهلاك الأكسجين عاد إلى الحد الأدنى من المستوى. الرجاء تجنب استخدام عازلة تحلل الخلايا الحمراء لعزل الخلية أحادية النوى. نوصي فصل التدرج فيول لمنع تشكيل تكتل والحد من فقدان LSK.
باستخدام أسلوبنا الأمثل، يمكننا قياس التنفس الميتوكوندريا وتحلل الخلايا الجذعية والخلايا السلف النادرة والهشة ودراسة الإشارات الأيضية تنظيم الدم الطبيعي والخبيث.
