所述协议允许对骨髓造血干和祖细胞以及骨髓基质细胞进行表型分析。它可用于研究不同环境中对这些人群的扰动。与先前描述的其他方法相比，该技术允许对造血细胞进行表型分析，特别是在两个功能性骨髓区域，内膜和中央骨髓以及骨髓基质细胞。
首先，将安乐死的动物腹部朝上放在培养皿上，并喷洒70%乙醇。用剪刀在腹部上方切开，将皮肤一直拉到脚踝。抓住其中一条腿，用剪刀剪开它的底部，将其与动物分开。
然后通过切割脚踝将脚从腿上移开，并将腿放在冰冷的PBS 2%FBS中。接下来，用镊子抓住髋骨并在它后面剪开，用剪刀将其与动物分开。将髋骨放入冰冷的PBS 2%FBS中。
将腿骨和髋骨放入培养皿中后，使用无菌手术刀清洁骨头。然后用手术刀在膝盖上切开胫骨和股骨，并将干净的骨头放入冰冷的PBS 2%FBS中。将股骨或胫骨放入装有冰冷PBS 2%FBS的研钵中，并用研杵将其轻轻按压在研钵壁上，将骨头压碎。
接下来，使用10毫升移液器上下移液所得细胞悬液以均质化并通过放置在管顶部的40微米细胞过滤器将其转移到50毫升管中。用更多的PBS 2%FBS冲洗砂浆，并通过相同的40微米细胞过滤器将溶液转移到相同的50毫升管中。将 50 毫升管以 500 G 在 4 摄氏度下离心五分钟。
弃去上清液后，在室温下上下移液数次，将细胞沉淀重悬于5毫升红细胞裂解缓冲液中。在室温下孵育两分钟后，加入15毫升PBS 2%FBS并离心50毫升管。如果细胞沉淀看起来不发红，则弃去上清液，将沉淀重悬于200微升PBS 2%FBS中，并将细胞悬液转移到96孔V底板的孔中进行染色。
如前所述压碎骨头后，用剪刀剪下P1000移液器的尖端，并用它来将研钵的所有内容物转移到50毫升的管中。然后将 50 毫升管以 500 G 在 4 摄氏度下离心五分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于三毫升胶原酶IV和该分散酶II溶液中。
将试管在 37 摄氏度下孵育 40 分钟。用PBS 2%FBS将试管加满至25毫升，然后涡旋混合。接下来，通过100微米的细胞过滤器将内容物转移到新的50毫升管中。
然后将15毫升PBS 2%FBS加入旧的50毫升管中，并通过100微米细胞过滤器将溶液转移到新的50毫升管中。离心并弃去上清液后，用移液管上下移液数次，将细胞沉淀重悬于5毫升红细胞裂解缓冲液中。在室温下孵育两分钟后，加入15毫升PBS 2%FBS。
再次，离心管，如果丢弃上清液后细胞沉淀看起来不发红，则将沉淀重悬于200微升PBS 2%FBS中，并将细胞悬液转移到96孔V底板的孔中进行染色。然后将板以500 G在4摄氏度下离心三分钟。将股骨放在培养皿上，并使用无菌手术刀切割骨头的末端。
然后使用无死体积0.5毫升胰岛素注射器将100微升PBS 2%FBS从每侧穿过骨内部一次，并将溶液收集在含有1毫升PBS 2%FBS的微量离心管中，从而冲洗骨骼的中心部分。随后将细胞悬液转移到标记为含有4毫升PBS 2%FBS的冲洗骨髓的50毫升管中。用冰冷的PBS 2%FBS将骨头的末端用冰冷的PBS 2%FBS轻轻压在研钵壁上，将其压碎。
细胞悬液均质化后，通过40微米细胞过滤器将其转移到标记为碎骨髓的50毫升管中。最后，用更多的PBS 2%FBS冲洗砂浆，并将溶液转移到同一管中。在健康的年轻成年C57BL6J小鼠的总骨髓中进行造血干细胞和多能祖细胞的流式细胞术分析。
在分析总骨髓中的基质细胞、内皮细胞和间充质干细胞时，可以根据瘦素受体表达轻松鉴定间充质干细胞，根据CD31和SCA-1的表达可以鉴定内皮细胞。全骨髓内皮细胞的流式细胞术分析显示基于ICAM1的小动脉和正弦内皮细胞之间的区别。对中枢和内膜骨髓组织中动脉和正窦骨髓内皮细胞的定量表明，动脉骨髓内皮细胞在内分泌区域更丰富，而中央骨髓区域的正弦更常见。
当获得冲洗的骨髓时，不应超过通过PBS 2%FBS通过骨中央部分内部的体积或次数。将所描述的方法与所分析的细胞群的功能测定相结合，将提供有关在研究条件下发生的这些群体的潜在扰动的进一步有价值的信息。所描述的方案允许对内膜和中央骨髓中的造血细胞进行差异性分析，使研究人员能够研究在这些骨髓位置可能发生的血位扰动。
