Tanımlanan protokol, kemik iliği hematopoetik kök ve progenitör hücrelerinin ve kemik iliği stromal hücrelerinin fenotipik analizine izin verir. Farklı ortamlarda bu popülasyonlara yönelik pertürbasyonları incelemek için kullanılabilir. Daha önce tarif edilen diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu teknik, hematopoetik hücrelerin, özellikle iki fonksiyonel kemik iliği alanında, endosteal ve merkezi kemik iliği ve ayrıca kemik iliği stromal hücrelerinde fenotipik analizine izin verir.
Başlamak için, ötenazi yapılan hayvanı karnı yukarı bakacak şekilde bir Petri kabına yerleştirin ve% 70 etanol ile püskürtün. Makas kullanarak karın üstünde bir kesim yapın ve cildi ayak bileklerine kadar çekin. Bacaklarından birini tutun ve makas kullanarak hayvandan ayırmak için altından kesin.
Daha sonra ayak bileğini keserek ayağı bacaktan çıkarın ve bacağı buz gibi PBS% 2 FBS'ye yerleştirin. Ardından, cımbız kullanarak kalça kemiğini tutun ve makas kullanarak hayvandan ayırmak için arkasını kesin. Kalça kemiğini buz gibi PBS% 2 FBS'ye yerleştirin.
Bacak ve kalça kemiğini bir Petri kabına yerleştirdikten sonra, steril bir neşter kullanarak kemikleri temizleyin. Daha sonra neşterle dizden keserek tibia ve femuru ayırın ve temiz kemikleri buz gibi PBS% 2 FBS'ye yerleştirin. Femur veya tibiayı buz gibi PBS% 2 FBS ile bir harç içine yerleştirin ve havaneli kullanarak harcın duvarına hafifçe bastırarak kemiği ezin.
Daha sonra, elde edilen hücre süspansiyonunu homojenize etmek ve tüpün üzerine yerleştirilen 40 mikrometrelik bir hücre süzgeci aracılığıyla 50 mililitrelik bir tüpe aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyin. Harcı biraz daha PBS% 2 FBS ile durulayın ve çözeltiyi aynı 40 mikrometre hücre süzgecinden aynı 50 mililitrelik tüpe aktarın. 50 mililitrelik tüpü 500 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin.
Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini oda sıcaklığında beş mililitre RBC lizis tamponunda birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında iki dakikalık bir inkübasyonun ardından, 15 mililitre PBS% 2FBS ekleyin ve 50 mililitrelik tüpü santrifüj edin. Hücre pelet kırmızımsı görünmüyorsa, süpernatanı atın, pelet 200 mikrolitre PBS% 2 FBS'de yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu boyama için 96 delikli bir V alt plaka kuyucuğuna aktarın.
Kemiği daha önce gösterildiği gibi ezdikten sonra, makas kullanarak bir P1000 pipetinin ucunu kesin ve harcın tüm içeriğini 50 mililitrelik bir tüpe aktarmak için kullanın. Daha sonra 50 mililitrelik tüpü 500 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti üç mililitre kollajenaz IV ve bu dispase-II çözeltisinde yeniden askıya alın.
Tüpü 40 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Tüpü PBS% 2 FBS ve karıştırmak için vorteks ile 25 mililitreye doldurun. Ardından, içeriği 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın.
Daha sonra eski 50 mililitrelik tüpe 15 mililitre PBS% 2 FBS ekleyin ve çözeltiyi 100 mikrometre hücre süzgecinden yeni 50 mililitrelik tüpe aktarın. Süpernatanı santrifüj edip attıktan sonra, bir pipetle birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini beş mililitre RBC lizis tamponunda yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında iki dakikalık inkübasyonu takiben, 15 mililitre PBS% 2 FBS ekleyin.
Yine, tüpü santrifüj edin ve süpernatanı attıktan sonra hücre pelet kırmızımsı görünmüyorsa, peleti 200 mikrolitre PBS% 2 FBS'de yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu boyama için 96 delikli bir V alt plaka kuyucuğuna aktarın. Daha sonra plakayı dört santigrat derecede üç dakika boyunca 500 G'de santrifüj edin. Femuru bir Petri kabına yerleştirin ve steril bir neşter kullanarak kemiğin uçlarını kesin.
Daha sonra, 100 mikrolitre PBS% 2 FBS'yi kemiğin içinden bir kez geçirerek, ölü hacimsiz 0.5 mililitre insülin şırıngası kullanarak ve çözeltiyi bir mililitre PBS% 2 FBS içeren bir mikrosantrifüj tüpünde toplayarak kemiğin orta kısmını yıkayın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu, dört mililitre PBS% 2 FBS içeren kızarmış kemik iliği olarak etiketlenmiş 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Kemiğin uçlarını buz gibi PBS% 2 FBS ile bir harçta ezin, havaneli kullanarak harcın duvarına hafifçe bastırın.
Hücre süspansiyonu homojenize edildikten sonra, 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden ezilmiş kemik iliği olarak etiketlenmiş 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Sonunda, harcı biraz daha PBS% 2FBS ile durulayın ve çözeltiyi aynı tüpe aktarın. Hematopoetik kök hücrelerin ve multipotent progenitörlerin akım sitometri analizi, sağlıklı bir genç yetişkin C57BL6J farede total kemik iliğinde yapıldı.
Total kemik iliğindeki stromal hücrelerin, endotel hücrelerinin ve mezenkimal kök hücrelerin analizinde, leptin reseptör ekspresyonuna dayanarak mezenkimal kök hücreler kolayca tanımlanabilir ve CD31 ve SCA-1 ekspresyonuna dayanarak endotel hücreleri tanımlanabilir. Toplam kemik iliğindeki endotel hücrelerinin akış sitometrisi analizi, arteriyolar ve sinüzoidal endotel hücreleri arasındaki ayrımı ICAM1'e dayanarak göstermektedir. Santral ve endosteal kemik iliği dokusundaki arteriyel ve sinüzoidal kemik iliği endotel hücrelerinin niceliklendirilmesi, arteriyel kemik iliği endotel hücrelerinin endosteal bölgelerde daha bol olduğunu, sinüzoidlerin ise santral kemik iliği bölgelerinde daha sık olduğunu göstermektedir.
Kızarmış kemik iliği elde edilirken, PBS% 2 FBS'yi kemiğin orta kısmının iç kısmından geçirmek için belirtilen hacim veya sayı aşılmamalıdır. Tarif edilen yöntemin fenotipik olarak analiz edilen hücre popülasyonlarının fonksiyonel tahlilleri ile birleştirilmesi, çalışılan koşullarda meydana gelen bu popülasyonlara yönelik potansiyel bozulmalar hakkında daha değerli bilgiler sağlayacaktır. Tarif edilen protokol, endosteal ve santral kemik iliğinde hematopoetik hücrelerin fenotipik analizine izin vererek, araştırmacıların özellikle bu kemik iliği bölgelerinde potansiyel olarak ortaya çıkan hematopiezis pertürbasyonlarını araştırmalarını sağlar.
