يقدم هذا البروتوكول طريقة موحدة لتحديد هوية الخلايا المناعية والنقاء ، ويعالج قيودًا على عملية استئصال الخلايا التدفقية مثل متطلبات العينة الكبيرة ، وارتفاع معدل التغير المستخدم ، وتحليل البيانات الذاتي. يتضمن هذا الفحص قالب تحليل البيانات الآلي الذي يسمح للمستخدمين بتقييم هوية الخلايا المناعية والنقاء بموضوعية. هذا، جنبا إلى جنب مع ضوابط المقايسة متعددة يقدم تسليم المفتاح، طريقة موحدة بسهولة لتقييم هوية الخلية المناعية والنقاء.
إثبات هذه التقنية سيكون جيري جوزمان، عالم في مختبرنا. بعد عزل الحمض النووي الجينومي عن عينة الخلايا ال دموي الفائدة، استخدم ميكرولتر واحد من الحمض النووي الجينومي لقياس نقاء العينة على مقياس الطيف الضوئي عن طريق الحصول على الكثافة البصرية عند 260 و280 و 230 نانومتر. التالي تمييع 400 إلى 1200 نانوغرام من عينة الحمض النووي الجينومية إلى حجم النهائي من 142 ميكرولترات مع عازلة elution من مجموعة عزل الحمض النووي الجينومية.
إضافة 75 ميكرولترات من معايرة إلى 67 ميكرولترات من عازلة elution. وتمييع 1200 نانوجرام من الحمض النووي الجينومي المرجعي إلى حجم إجمالي من 142 ميكرولترات مع عازلة elution. ثم احتضان الأنابيب لمدة خمس دقائق في 56 درجة مئوية و 900 الثورات في الدقيقة الواحدة في خلاط الحرارية.
لتحويل ثنائي السلفيت، إضافة 270 ميكرولترات من البيسولفيت الأمونيوم و 90 ميكرولترات من THFA إلى جميع الأنابيب. ودوامة الأنابيب لضمان خلط شامل. تدور لفترة وجيزة أسفل العينات لجمع السائل ووضع الأنابيب في خلاط الحرارية لمدة 45 دقيقة في 80 درجة مئوية و 900 الثورات في الدقيقة الواحدة.
ثم تدور لفترة وجيزة أسفل العينات مرة أخرى والسماح لهم لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. لتنقية الحمض النووي بعد تحويل ثنائي الفيتيت، دوامة الخرز ال DNA عزل بارامغناطيسية لمدة 30 ثانية. إضافة الإيثانول وisopropanol إلى مخازن الغسيل وفقا للمجلدات المدرجة على الزجاجات.
دوامة مرة أخرى حتى يتم resuspended الخرز تماما وعلى 870 microliters من العازلة ملزمة تحلل و 105 ميكرولترات من الخرز الحمض النووي ملزمة بارامغناطيسية لكل أنبوب. دوامة الأنابيب لخلط قبل الغزل لفترة وجيزة أسفل العينات. إضافة 570 ميكرولترات من 2-بروبانول إلى كل أنبوب ومزيج من دوامة.
احتضان الأنابيب لمدة سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة و 50 دورة في الدقيقة قبل أن تدور لفترة وجيزة أسفل الأنابيب مرة أخرى ووضعها على رف مغناطيسي لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة إزالة supernate دون إزعاج الخرز. غسل العينة مع العازلة 1 ودوامة الأنابيب.
بعد وضع الطرد المركزي وجيزة الأنابيب مرة أخرى في الرف لمدة ثلاث دقائق وإزالة السوبر دون إزعاج الخرز. اغسل العينة مرتين مع عازلة غسل 2 وتجفيف الأنابيب في 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. المقبل، إضافة 60 microliters تطور العازلة لكل أنبوب.
بعد حضانة لمدة سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة و 1400 دوران في الدقيقة الواحدة ، تدور لفترة وجيزة أسفل الأنابيب والعودة الأنابيب إلى المغناطيس لمدة دقيقتين. في نهاية عملية الحضانة نقل 55 microliters من ثنائي السلفيت تحويل الحمض النووي تحتوي على أنبوب جديد دون إزعاج الخرز. لتشغيل PCR الكمية على العينات، تعيين كل معيار المهمة القياسية في البرنامج PCR الكمية وتحديد أرقام النسخة النهائية وفقا للجدول.
إعداد التخفيفات التسلسلية من الحمض النووي القياسية وإعداد مزيج واحد PCR ماجستير كمية لنوع الخلية المستهدفة. وواحد كمية PCR ماجستير مزيج كوكتيل لD GAPDH، وفقا للجدول. تحميل ثلاثة microliters من الحمض النووي قالب في الآبار المناسبة من 96 لوحة أسفل مدورة جيدا تليها سبعة ميكرولترات من مزيج رئيسي.
عندما تم تحميل جميع الآبار ختم لوحة مع فيلم PCR الكمية وتدور لفترة وجيزة لوحة قبل تحميلها على صك PCR الكمية. ثم تشغيل رد الفعل كما هو مبين في الجدول. عند اكتمال التشغيل تصدير بيانات PCR الكمية كملف txt أو xlsx.
بعد تنقية الـ bisulfite تحويل الحمض النووي مع ضربات البارامغناطيسية كما هو مبين، elute 25 ميكرولترات من الحمض النووي. نقل الحمض النووي ثنائي الفقار إلى أنبوب جديد وإضافة اثنين من ميكرولترات العينة إلى أنابيب قطاع PCR الفردية. إضافة اثنين microliters من الماء إلى أنبوب التحكم في قالب لا وإعداد مزيج ماجستير preamplification لجميع العينات وفقا للجدول.
إضافة 23 ميكرولترات من مزيج ماجستير لكل أنبوب وغطاء، دوامة، وتدور لفترة وجيزة أسفل الأنابيب. ثم تشغيل بروتوكول preamplification على دورة حرارية باستخدام غطاء ساخنة. بعد اكتمال المدى ، تدور لفترة وجيزة أسفل الأنابيب ونقلها إلى microliters من الحمض النووي تضخيمها إلى أنابيب جديدة.
ثم تمييع العينات مع 78 ميكرو لتر من الماء إلى تركيز واحد إلى 40 وتشغيل PCR كمي للعينات كما هو موضح. هنا، تظهر بيانات تمثيلية من مقايسة خلية CD8 +T تم الحصول عليها من تحليل كل من الدم المحيطي والخلايا أحادية النوى والخلايا التائية من ثلاثة متبرعين مختلفين باستخدام كل من قياس التدفق ومقايسات الميثيل. وكانت الاتجاهات بين الطريقتين عبر جميع المانحين في كلا النوعين من الخلايا متشابهة.
وتظهر هذه البيانات التمثيلية من فحص Treg نتائج مماثلة بين الأساليب. ومع ذلك، في جميع الحالات، أسفرت هذه الحسبة الميثيل عن قيم أعلى في ظل ظروف محفزة وغير مُحفزة على حد سواء. وقد تم إظهار حساسية وخصوصية كل مقايسة من خلال قيم الحد من الفراغ، والحد من الكشف، والحد من الكمية.
نظرًا لأن هذا الفحص يقدم قالب تحليل تلقائي للبيانات، فإنه يحسن التحليل الموضوعي ويزيد من قدرات التوحيد القياسي. هذا هو المثل الأعلى لتصنيع العلاج بالخلايا حيث أساليب موحدة حاسمة لخلق منتج العلاج الخلوي متسقة.
