تتيح هذه التقنية أخذ عينات من الذوبان من سمكة نموذجية صغيرة ، Madaka اليابانية ، والتحقيق في جودتها بطريقة متسقة. على وجه التحديد جمع الحيوانات المنوية عن طريق تدليك البطن يسمح بأخذ عينات متكررة على نفس الأسماك لأن هذا النهج ليس غازيا. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق هذه التقنية لحفظ الحيوانات المنوية بالتبريد في ماداكا.
تعد جودة الحيوانات المنوية مؤشرا أساسيا لنجاح الإخصاب ، وبالتالي فهي معلمة مهمة يجب تحليلها في دراسات علم وظائف الأعضاء البيئية والإنتاجية الكاملة. للبدء ، قم بإعداد إسفنجة ناعمة ، عن طريق تقطيعها لتناسب متعجرف في طبق بتري. اقطع خطا مستقيما في منتصف الإسفنجة ، وهو طويل بما يكفي لتثبيت السمكة على جانبها البطني.
بعد تخدير الأسماك ، جفف بطن السمكة عن طريق مسحها برفق بمنشفة ورقية. ضع السمكة في حوض الإسفنجة الرطبة مع الجانب البطني لأعلى ، بحيث تتعرض خياشيمها لمحلول التخدير في الإسفنجة. إذا كانت المنطقة المحيطة بالعباءة مبللة ، جفف الجانب السفلي من البطن برفق بمسح منديل يمكن التخلص منه.
تحت مجهر تشريح ، ضع الماصة الدقيقة مع أنبوب شفاط متصل ضد عباءة السمكة. الآن قم بتدليك بطن السمكة عن طريق الضغط بلطف بملقط ناعم نهاية حادة في حركة منضدية إلى الذيلية. لاستعادة الأسماك ، حررها من الإسفنج إلى ماء الاسترداد المعد مسبقا قبل إعادة الأسماك إلى نظام الحوض.
انقل الذوبان الذي تم جمعه إلى أنبوب يحتوي على محلول تنشيط مسخن مسبقا ومحلول ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام مجموعة أنبوب الشفاط. قم بتجانس الحيوانات المنوية المخففة برفق عن طريق تحريك الأنابيب قبل التحليل. بعد القتل الرحيم ، جفف السمك كما هو موضح سابقا وضع السمكة تحت مجهر تشريح مع توجيه جانبها الجانبي الأيسر لأعلى.
باستخدام مقص تشريح صغير ، قم بقطع رفرف ظهريا من العباءة ثم عبر الأضلاع إلى الخياشيم لفضح الأعضاء الداخلية. حدد موقع الخصيتين واقطع المرفق من كلا الطرفين بالملقط الناعم. قم بإزالة الخصيتين ونقلهما إلى أنبوب معد يحتوي على محلول تنشيط مسخن مسبقا.
استخدم الملقط لسحق الخصيتين عدة مرات على جانب الأنبوب لتحرير الحيوانات المنوية ، والتي يمكن تصورها من خلال المظهر الغائم قليلا للمحلول. لبدء التحليل ، افتح برنامج تحليل الحيوانات المنوية وحدد وحدة الحركة. قم بتعيين التكوينات في البرنامج لجميع المعلمات.
ضع شريحة غرفة عد 20 ميكرومتر يمكن تسخينها مسبقا تحت المجهر على مرحلة ساخنة ، مضبوطة على 27 درجة مئوية. ماصة العينة في الحجرة على الشريحة حتى تمتلئ ، ولكن دون ملء زائد. امسح بعناية العينات الزائدة من مدخل الغرفة لمنع حركة الانجراف للخلايا في المحلول.
حدد تحليل لإلقاء نظرة على العينة تحت المجهر. تأكد من تركيز المجهر وحدد التحليل مرة أخرى لتسجيل الحيوانات المنوية في الحقل. انقل الشريحة إلى منطقة جديدة من العينة في الإطار وكرر الإجراء لثلاثة إلى خمسة مجالات رؤية مختلفة ، وتجنب فقاعات الهواء أو كتل الخلايا أو القطع الأثرية.
لعرض النتائج ، حدد النتائج ، وانقر نقرا مزدوجا فوق حقل لتصور الحقل الفردي أو للتحقق يدويا من أي منوية تم تسميتها بشكل خاطئ أو غير متعقبة. إذا لزم الأمر ، انقر بزر الماوس الأيمن على الحيوانات المنوية الفردية لإعادة تسمية الحركة. في هذه الدراسة ، تم استخدام تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر لتسجيل مختلف معلمات السرعة والحركة.
تتضمن القيم المحسوبة مؤشر الاستقامة ومؤشر الخطية والتذبذب. أثرت تناضحية محاليل التنشيط على حركة الحيوانات المنوية من تشريح الخصيتين. كانت الحيوانات المنوية غير متحركة في ماء الحوض ، ولكنها متحركة في HBSS ذات أسمولية عالية ومنخفضة.
ومع ذلك ، يتم تقليل الحركة بشكل كبير عند 36 مللي أوسمول لكل كيلوغرام ، مقارنة بالمحاليل الأسمولية الأعلى. تأثرت الحركة أيضا بطريقة جمع الحيوانات المنوية ، حيث تكون الحيوانات المنوية أكثر حركة بشكل ملحوظ في طريقة تشريح الخصية مقارنة بتدليك البطن. أيضا ، كانت نسبة أعلى من الخلايا تقدمية والمزيد من الخلايا كانت إما متوسطة أو سريعة الحركة.
النسبة المئوية للحركة والتقدمية أعلى بكثير في الحيوانات المنوية المخزنة عند أربع درجات مئوية أو على الجليد ، مقارنة بتخزين 27 درجة مئوية. كما أثرت الظروف البيئية والسكنية بشكل طفيف على حركة الحيوانات المنوية. لم يلاحظ أي اختلاف كبير في حركة الحيوانات المنوية في الحيوانات المنوية التي تم جمعها بعد وقبل التفريخ.
أظهر الذكور الذين تم إيواؤهم بدون إناث لمدة شهر حركة عالية ، لكن الفرق كان ضئيلا. لجمع الحيوانات المنوية عن طريق تدليك البطن ، هناك حاجة إلى التدريب لتعلم ضغط وحركة الملقط المناسبة وتجنب التلوث الزائد. ستكون هذه التقنية مفيدة جدا للتحقيق على سبيل المثال ، في آثار الملوثات المتنوعة على خصوبة الذكور في دراسات السمية البيئية ، حيث يعد Medaka نموذجا شائع الاستخدام.
