この技術により、小型モデル魚「ニホンマダカ」から白子を採取し、その品質を一貫して調査することができます。具体的には、腹部マッサージによる精子採取は、このアプローチが侵襲的ではないため、同じ魚で繰り返しサンプリングすることを可能にする。さらに、この技術は、マダカ精子凍結保存にも応用できる。
精子の質は受精の成功の重要な指標であり、したがって生態学的および全体的な生産的生理学研究で分析するための重要なパラメータです。はじめに、ペトリ皿にこっそり収まるようにそれを切って、柔らかい保持スポンジを準備します。スポンジの真ん中で、魚の腹側を上に保持するのに十分な長さの直線を切ります。
魚を麻酔した後、ペーパータオルでそっと拭いて魚の腹部を乾かします。腹側を上にして湿った保持スポンジのトラフに魚を置き、そのえらがスポンジの麻酔液にさらされるようにします。クロアカの周りが濡れている場合は、使い捨てのティッシュワイプで腹部の下側をそっと乾かします。
解剖顕微鏡下で、アスピレーターチューブを取り付けたマイクロピペットを魚のクロアカに当てます。今度は吻側から尾側への動きで鈍い端の滑らかな鉗子で優しく絞ることによって魚の腹部をマッサージします。魚を回収するには、魚を水槽システムに戻す前に、スポンジから事前に準備した回収水にそれを解放します。
集めた白子を予熱した活性化溶液とピペット溶液を含むチューブに移し、アスピレーターチューブアセンブリを使用して数回上下させます。分析前にチューブをフリックして、希釈した精子を穏やかに均質化します。魚を安楽死させた後、前に示したようにそれを乾燥させ、魚を左側の側面を上に向けて解剖顕微鏡の下に置きます。
小さな解剖ハサミを使用して、クロアカから背側のフラップを切り取り、次に肋骨を横切ってえらまで内臓を露出させます。精巣を見つけ、細かい鉗子で両端のアタッチメントを切ります。精巣を取り出し、予熱した活性化溶液を含む準備されたチューブに移します。
鉗子を使用して精巣をチューブの側面に対して数回押しつぶして精子を放出しますが、これは溶液のわずかに曇った外観で視覚化できます。分析を開始するには、精子分析ソフトウェアを開き、運動性モジュールを選択します。すべてのパラメータのソフトウェアで構成を設定します。
あらかじめ温めた使い捨ての20マイクロメートル計数チャンバースライドを、摂氏27度に設定された加熱ステージ上の顕微鏡下に置きます。サンプルがいっぱいになるまでスライド上のチャンバーにサンプルをピペットで入れますが、過剰充填することはありません。チャンバーの入り口から余分なサンプルを注意深く拭き取り、溶液中の細胞のドリフト移動を防ぎます。
分析を選択して、顕微鏡でサンプルを確認します。顕微鏡の焦点が合っていることを確認し、もう一度分析を選択して、フィールドの精子を記録します。スライドをフレーム内のサンプルの新しい領域に移動し、気泡、細胞塊、またはアーチファクトを避けて、3〜5つの異なる視野に対して手順を繰り返します。
結果を表示するには、結果を選択し、フィールドをダブルクリックして個々のフィールドを視覚化するか、ラベル付けされていない精子や追跡されていない精子を手動で確認します。必要に応じて、個々の精子を右クリックして運動性を再ラベル付けします。本研究では、コンピューター支援精子分析を使用して、さまざまな速度と運動パラメーターを記録しました。
計算値には、真直度指数、線形性指数、およびぐらつきが含まれます。活性化溶液の浸透圧は、精巣の解剖による精子の運動性に影響を与えました。精子は水槽水中では不動であったが、高浸透圧および低浸透圧を有するHBSS中で運動性であった。
しかしながら、運動性は、より高い浸透圧溶液と比較して、キログラム当たり36ミリオスモルで有意に低下する。運動性は精子採取法の影響も受けており、精子は腹部マッサージと比較して精巣解剖法で有意に運動性が高い。また、より高い割合の細胞が進行性であり、より多くの細胞が中程度または急速に移動していた。
運動性と進行性の割合は、摂氏27度の貯蔵と比較して、摂氏4度または氷上に保存された精子で有意に高くなります。環境条件と住居条件も精子の運動性にわずかに影響を与えました。産卵前後に採取した精子では精子の運動性に有意差は見られなかった。
1ヶ月間女性なしで飼育された男性は高い運動性を示したが、その差はわずかであった。腹部マッサージによる精子採取では、適切な鉗子の圧力と動きを学び、糞便汚染を回避するためのトレーニングが必要です。この手法は、例えば、メダカが一般的に使用されるモデルである生態毒性研究における男性の生殖能力に対する多様な汚染物質の影響を調査するのに非常に役立ちます。
