Diese Technik ermöglicht die Probenahme von Milz von einem kleinen Modellfisch, dem japanischen Madaka, und die Untersuchung seiner Qualität in konsistenter Weise. Insbesondere die Spermienentnahme durch Bauchmassage ermöglicht eine wiederholte Probenahme am selben Fisch, da dieser Ansatz nicht invasiv ist. Darüber hinaus kann diese Technik für die Madaka-Spermien-Kryokonservierung angewendet werden.
Die Spermienqualität ist ein wesentlicher Indikator für den Befruchtungserfolg und daher ein wichtiger Parameter, der in ökologischen und gesamten produktiven physiologischen Studien analysiert werden muss. Bereiten Sie zunächst einen weichen Halteschwamm vor, indem Sie ihn so schneiden, dass er selbstgefällig in eine Petrischale passt. Schneiden Sie eine gerade Linie in der Mitte des Schwamms, die lang genug ist, um den Fisch auf seiner Bauchseite nach oben zu halten.
Nachdem Sie den Fisch betäubt haben, trocknen Sie den Bauch des Fisches, indem Sie ihn vorsichtig mit einem Papiertuch abwischen. Legen Sie den Fisch mit der Bauchseite nach oben in den Trog des feuchten Halteschwamms, so dass seine Kiemen der Anästhesielösung im Schwamm ausgesetzt sind. Wenn der Bereich um die Kloake nass ist, trocknen Sie die Unterseite des Bauches vorsichtig mit einem Einwegtuchtuch ab.
Legen Sie die Mikropipette mit einem angebrachten Absaugrohr unter einem Seziermikroskop gegen die Kloake des Fisches. Massieren Sie nun den Bauch des Fisches, indem Sie ihn sanft mit einer stumpfen glatten Pinzette in einer rostralen bis kaudalen Bewegung zusammendrücken. Um den Fisch zu erholen, geben Sie ihn aus dem Schwamm in das zuvor vorbereitete Erholungswasser, bevor Sie den Fisch in das Aquariensystem zurückbringen.
Die gesammelte Milz wird in ein Röhrchen mit vorgewärmter Aktivierungslösung und Pipettenlösung mehrmals mit der Ansaugrohrbaugruppe nach oben und unten überführt. Homogenisieren Sie das verdünnte Sperma vorsichtig, indem Sie die Röhrchen vor der Analyse schnippen. Nach dem Einschläfern trocknen Sie den Fisch wie zuvor demonstriert und legen Sie den Fisch mit der linken seitlichen Seite nach oben unter ein Seziermikroskop.
Schneiden Sie mit einer kleinen Sezierschere einen Lappen dorsal von der Kloake und dann über die Rippen zu den Kiemen, um die inneren Organe freizulegen. Suchen Sie die Hoden und schneiden Sie den Aufsatz an beiden Enden mit einer feinen Pinzette ab. Entfernen Sie die Hoden und geben Sie sie in ein vorbereitetes Röhrchen mit vorgewärmter Aktivierungslösung.
Verwenden Sie die Pinzette, um die Hoden mehrmals gegen die Seite der Röhre zu drücken, um das Sperma freizusetzen, was durch das leicht trübe Aussehen der Lösung sichtbar gemacht werden kann. Um die Analyse zu starten, öffnen Sie die Spermienanalysesoftware und wählen Sie das Motilitätsmodul. Stellen Sie die Konfigurationen in der Software für alle Parameter ein.
Legen Sie einen vorgewärmten Einweg-20-Mikrometer-Zählkammerobjektträger unter das Mikroskop auf einen beheizten Tisch, der auf 27 Grad Celsius eingestellt ist. Pipettieren Sie die Probe in die Kammer auf dem Objektträger, bis sie gefüllt ist, jedoch ohne Überfüllung. Wischen Sie überschüssige Proben vorsichtig vom Eingang der Kammer ab, um eine Driftbewegung der Zellen in der Lösung zu verhindern.
Wählen Sie Analysieren, um die Probe unter dem Mikroskop zu betrachten. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop fokussiert ist, und wählen Sie erneut analysieren, um die Spermien im Feld aufzuzeichnen. Bewegen Sie den Objektträger in einen neuen Bereich der Probe im Rahmen und wiederholen Sie den Vorgang für drei bis fünf verschiedene Sichtfelder, wobei Luftblasen, Zellmassen oder Artefakte vermieden werden.
Um die Ergebnisse anzuzeigen, wählen Sie Ergebnisse aus und doppelklicken Sie auf ein Feld, um das einzelne Feld zu visualisieren oder manuell nach falsch beschrifteten oder nicht verfolgten Spermatozoen zu suchen. Klicken Sie bei Bedarf mit der rechten Maustaste auf einzelne Spermatozoen, um die Motilität neu zu kennzeichnen. In der vorliegenden Studie wurde mittels computergestützter Spermienanalyse verschiedene Geschwindigkeits- und Bewegungsparameter erfasst.
Zu den berechneten Werten gehören der Geradheitsindex, der Linearitätsindex und der Wobble. Die Osmolarität der Aktivierungslösungen beeinflusste die Beweglichkeit der Spermien aus der Sektion der Hoden. Die Spermien waren im Aquarienwasser unbeweglich, aber beweglich in HBSS mit hoher und niedriger Osmolarität.
Die Motilität ist jedoch bei 36 Milli-Osmol pro Kilogramm im Vergleich zu Lösungen mit höherer Osmolalität signifikant reduziert. Die Motilität wurde auch durch die Spermiensammelmethode beeinflusst, bei der die Spermien bei der Hodendissektionsmethode im Vergleich zur Bauchmassage signifikant beweglicher sind. Außerdem war ein höherer Prozentsatz der Zellen progressiv und mehr Zellen bewegten sich entweder mittel oder schnell.
Die prozentuale Motilität und Progressivität sind bei den bei vier Grad Celsius oder auf Eis gelagerten Spermien signifikant höher als bei einer Lagerung von 27 Grad Celsius. Die Umwelt- und Haltungsbedingungen beeinflussten auch leicht die Beweglichkeit der Spermien. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Spermienmotilität in den Spermien beobachtet, die nach und vor dem Laichen gesammelt wurden.
Männchen, die einen Monat lang ohne Weibchen untergebracht waren, zeigten eine hohe Motilität, aber der Unterschied war unbedeutend. Für die Spermienentnahme durch Bauchmassage ist ein Training erforderlich, um den richtigen Druck und die richtige Bewegung der Pinzette zu erlernen und eine Kotkontamination zu vermeiden. Diese Technik wird sehr nützlich sein, um beispielsweise die Auswirkungen verschiedener Schadstoffe auf die männliche Fruchtbarkeit in ökotoxikologischen Studien zu untersuchen, in denen Medaka ein häufig verwendetes Modell ist.
