Bu teknik, küçük bir model balık olan Japon Madaka'dan süt örneklemesini ve kalitesinin tutarlı bir şekilde araştırılmasını sağlar. Özellikle karın masajı ile sperm toplanması, bu yaklaşım invaziv olmadığı için aynı balık üzerinde tekrarlanan örneklemeye izin verir. Ayrıca bu teknik Madaka sperm kriyosunun korunması için de uygulanabilir.
Sperm kalitesi döllenme başarısının önemli bir göstergesidir ve bu nedenle ekolojik ve tüm üretken fizyoloji çalışmalarında analiz edilmesi gereken önemli bir parametredir. Başlamak için, bir Petri kabına kendini beğenmiş bir şekilde sığacak şekilde keserek yumuşak bir tutma süngeri hazırlayın. Süngerin ortasında, balıkları ventral tarafında tutacak kadar uzun olan düz bir çizgi kesin.
Balıkları uyuşturduktan sonra, balığın karnını bir kağıt havluyla hafifçe silerek kurulayın. Balıkları nemli tutma süngerinin oluğuna ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin, böylece solungaçları süngerdeki anestezik çözeltiye maruz kalır. Kloak etrafındaki alan ıslaksa, karnın alt tarafını tek kullanımlık bir doku mendili ile hafifçe kurulayın.
Diseksiyon mikroskobu altında, mikro pipeti bağlı bir aspiratör tüpü ile balığın kloakasına yerleştirin. Şimdi balığın karnına, künt uçlu pürüzsüz forseps ile rostral ila kaudal bir hareketle hafifçe sıkarak masaj yapın. Balığın geri kazanılması için, balıkları akvaryum sistemine geri döndürmeden önce süngerden önceden hazırlanmış geri kazanım suyuna bırakın.
Toplanan sütü, aspiratör tüp tertibatını kullanarak önceden ısıtılmış aktivasyon çözeltisi ve pipet çözeltisi içeren bir tüpe birkaç kez yukarı ve aşağı aktarın. Seyreltilmiş spermi, analizden önce tüpleri hafifçe sallayarak homojenize edin. Ötenazi yaptıktan sonra balıkları daha önce gösterildiği gibi kurutun ve balığı, sol yan tarafı yukarı bakacak şekilde diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.
Küçük diseksiyon makası kullanarak, kloaktan dorsal olarak bir flep kesin ve daha sonra iç organları açığa çıkarmak için kaburgalardan solungaçlara doğru kesin. Testisleri bulun ve her iki uçtaki ataşmanı ince forsepslerle kesin. Testisleri çıkarın ve önceden ısıtılmış aktivasyon çözeltisi içeren hazırlanmış bir tüpe aktarın.
Spermi serbest bırakmak için testisleri tüpün yan tarafına karşı birkaç kez ezmek için forsepsleri kullanın, bu da çözeltinin hafif bulutlu görünümü ile görselleştirilebilir. Analize başlamak için sperm analiz yazılımını açın ve hareketlilik modülünü seçin. Tüm parametreler için yazılımdaki yapılandırmaları ayarlayın.
Önceden ısıtılmış tek kullanımlık 20 mikrometre sayma odası slaytını mikroskop altına 27 santigrat dereceye ayarlanmış ısıtılmış bir sahneye yerleştirin. Numuneyi, dolana kadar, ancak aşırı doldurmadan slayttaki hazneye pipetleyin. Çözeltideki hücrelerin sürüklenme hareketini önlemek için fazla numuneleri odanın girişinden dikkatlice silin.
Mikroskop altında örneğe bakmak için analiz et'i seçin. Mikroskopun odaklandığından emin olun ve spermi alana kaydetmek için tekrar analiz etmeyi seçin. Slaytı çerçevedeki numunenin yeni bir alanına taşıyın ve hava kabarcıklarından, hücre kütlelerinden veya yapıtlardan kaçınarak üç ila beş farklı görüş alanı için prosedürü tekrarlayın.
Sonuçları görüntülemek için sonuçları seçin ve tek tek alanı görselleştirmek veya yanlış etiketlenmiş ya da izlenmemiş spermatozoaları manuel olarak kontrol etmek için bir alana çift tıklayın. Gerekirse, motiliteyi yeniden etiketlemek için bireysel spermatozoaya sağ tıklayın. Bu çalışmada çeşitli hız ve hareket parametrelerinin kaydedilmesi için bilgisayar destekli sperm analizi kullanılmıştır.
Hesaplanan değerler düzlük endeksini, doğrusallık indeksini ve yalpalamayı içerir. Aktivasyon solüsyonlarının ozmolaritesi, testislerin diseksiyonundan elde edilen spermin hareketliliğini etkilemiştir. Spermler akvaryum suyunda hareketsizdi, ancak HBSS'de yüksek ve düşük ozmolariteye sahip hareketliydi.
Bununla birlikte, hareketlilik, daha yüksek ozmolalite çözeltilerine kıyasla, kilogram başına 36 mili osmolde önemli ölçüde azalır. Motilite, sperm toplama yönteminden de etkilenmiştir, burada spermler testis diseksiyon yönteminde abdominal masaja kıyasla önemli ölçüde daha hareketlidir. Ayrıca, hücrelerin daha yüksek bir yüzdesi ilerleyiciydi ve daha fazla hücre orta veya hızlı hareket ediyordu.
Yüzde hareketlilik ve progresiflik, dört santigrat derecede veya buz üzerinde depolanan spermlerde, 27 santigrat derece depolamaya kıyasla önemli ölçüde daha yüksektir. Çevre ve barınma koşulları da sperm motilitesini biraz etkiledi. Yumurtlamadan sonra ve yumurtlamadan önce toplanan spermlerde sperm motilitesinde anlamlı bir fark görülmedi.
Bir ay boyunca dişiler olmadan barındırılan erkekler yüksek hareketlilik gösterdi, ancak fark önemsizdi. Karın masajı ile sperm toplanması için, uygun forseps basıncını ve hareketini öğrenmek ve dışkı kontaminasyonunu önlemek için eğitim gereklidir. Bu teknik, örneğin, Medaka'nın yaygın olarak kullanılan bir model olduğu ekotoksikolojik çalışmalarda çeşitli kirleticilerin erkek doğurganlığı üzerindeki etkilerini araştırmak için çok yararlı olacaktır.
