مجمع المشبك هو عنصر رئيسي للانقسام الاختزالي. لدراسة وظيفتها ، يجب أن نفهم أيضا هيكلها الذي تبين أن الفحص المجهري فائق الدقة مفيد بشكل لا يصدق. لقد قمنا بتحسين بروتوكولنا لربط الغدد التناسلية C.elegans الملطخة بالمناعة بثبات بغطاء مما يساعد على تحسين الدقة حتى 30 نانومتر في الأنسجة السليمة.
يمكن أن يكون تصميم تجارب الفحص المجهري لتوطين جزيء واحد ، والتحليل اللاحق ، وكذلك تفسير البيانات أمرا صعبا للغاية ويجب إعداده بشكل أفضل مع خبير. ستوضح الإجراء إيفانا كافكا ، زميلة ما قبل الدكتوراه في المختبر. كما سيتم عرض الحصول على صور مجهرية توطين جزيء واحد من قبل روري باور ، مهندس بصري في مركز التصوير MBL.
ابدأ بقطف ديدان Caenorhabditis elegans المطابقة للعمر من ألواح أجار NGM. انقل الديدان إلى قطرة 30 ميكرولتر من EBTT على غطاء غطاء. اغسل الديدان ب 30 ميكرولتر إضافية من EBTT.
قم بإزالة 30 ميكرولتر من المحلول تاركا قطرة 30 ميكرولتر مع الديدان على غطاء الغطاء. استخدم شفرة مشرط لقطع رؤوس الديدان و / أو ذيولها لبثق الغدد التناسلية. في تشريح ناجح ، سيتم بثق أنسجة الغدد التناسلية بالكامل خارج جسم الدودة.
ماصة 30 ميكرولتر من محلول التثبيت في قطرة الديدان تشريح. تخلط عن طريق ماصة واترك العينات لإصلاح لمدة دقيقة واحدة. أوقف التثبيت بعد دقيقة واحدة بالضبط عن طريق نقل الديدان باستخدام ماصة 20 ميكرولتر على أنبوب PCR مملوء ب TBST.
ثم قم بإجراء غسل عن طريق تدوير العينات المشرحة على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة. بمجرد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الديدان في 200 ميكرولتر من TBST الطازج. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الديدان في 200 ميكرولتر من PBST وضع أنبوب PCR على الجليد.
قم بتدوير العينات المشرحة على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة وإزالة المادة الطافية. أضف 50 إلى 100 ميكرولتر من الميثانول البارد ، واخلطه عن طريق السحب ، واترك العينات في الميثانول لمدة 30 إلى 60 ثانية على الثلج. اغسل العينات مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من PBST.
بعد تدوير العينات وإزالة المادة الطافية ، أضف محلول الحجب إلى العينات واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 إلى 60 دقيقة. تمييع الأجسام المضادة الأولية لحلول العمل في المخزن المؤقت للحظر. قم بتدوير العينات على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة ، وإزالة محلول الحجب ، وإضافة 30 إلى 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي.
احتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، اغسل العينات ثلاث مرات في PBST. قم بتخفيف جزأين Fab Prime المسمى إلى حلول العمل في المخزن المؤقت للحظر.
بعد الغسيل الثالث ، قم بتدوير العينات لأسفل ، وإزالة المادة الطافية ، وإضافة 30 إلى 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي. ضع العينة في غرفة مظلمة واحتضنها لمدة 30 دقيقة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة خمس إلى 15 دقيقة.
قم بتدوير العينات الملطخة وإزالة المادة الطافية. أضف 50 ميكرولترا من PBST وانقل الديدان الملطخة إلى غطاء غطاء. ماصة 5.7 إلى 6.3 ميكرولتر من محلول ما بعد التثبيت على غطاء بولي ل لايسين.
ماصة قبالة الديدان تشريح في نفس الحجم ونقلها إلى قطرة من المثبت على غطاء بولي ل ليسين. قم بتغطية العينة بغطاء صغير. قم بإزالة السائل الزائد باستخدام قطعة صغيرة من ورق الترشيح وثبت العينة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في غرفة مظلمة.
قم بتجميد العينات عن طريق وضعها على كتلة من الألومنيوم في الثلج الجاف. بعد 20 دقيقة على الأقل ، قم بإزالة الغطاء الأصغر باستخدام ماكينة حلاقة. اغمس الغطاء في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر يحتوي على PBS بارد أو ميثانول مبرد عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 10 ثوان تقريبا.
ضع الغطاء في بئر من لوحة من ستة آبار مملوءة بمخزن مؤقت PBST. أخرج PBST من البئر ، وأضف PBST طازجا واترك العينة لمدة خمس دقائق. بعد الغسيل باستخدام PBST مرة أخرى ، اترك العينات عند أربع درجات مئوية حتى التصوير.
قبل التصوير ، قم بتقييم جودة تركيب العينة تحت مجهر ستيريو. في حالة استخدام حامل العينة المصنوع خصيصا الموضح هنا ، لف الحلقة المغناطيسية بالبارافيلم ، ثم قم بإعداد ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتصوير. خذ غطاء من لوحة الآبار الستة.
ضعه في الحامل المصنوع خصيصا وقم بتثبيت غطاء الغطاء في الحامل بحلقة مغناطيسية ملفوفة بالبارافيلم. ماصة برفق مخزن التصوير المؤقت في الحجرة التي أنشأتها الحلقة المغناطيسية أعلى العينة وأغلق الحجرة باستخدام البارافيلم. لتركيب العينة ، أضف قطرة واحدة من زيت الغمر إلى هدف الزيت النظيف.
دون إدخال أي هواء في زيت الغمر ، ضع حامل العينة برفق مع العينة المركبة على مرحلة المجهر. باستخدام نافذة المكون الإضافي EMU داخل MicroManager 2 ، حرك مرحلة بيزو حتى يتم اكتشاف الإشارة من ليزر قفل التركيز عند الصمام الثنائي الضوئي الربعي. احصل على صورة المستوى البؤري الخلفي عند طاقة أقل باستخدام ليزر عند إثارة 640 نانومتر لتأكيد عدم وجود فقاعات هواء في زيت الغمر.
توطين أنسجة الغدد التناسلية باستخدام إضاءة برايتفيلد. باستخدام إضاءة منخفضة الكثافة عند 640 نانومتر ، ركز على قسم الأنسجة الذي يحتوي على العديد من مجمعات المشابك العصبية. استمر في تعريض العينة عند إشعاع عال مع إضاءة عند 640 نانومتر لمدة 30 ثانية تقريبا حتى يتم تحقيق معدل وميض مناسب.
احصل على 200،000 إطار مع وقت تعريض يبلغ 20 مللي ثانية باستخدام أداة الاستحواذ متعددة الأبعاد في MicroManager 2. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد تنشيط الأشعة فوق البنفسجية باستخدام خيار التنشيط الخاص بالمكون الإضافي EMU للحفاظ على معدل الوميض المطلوب. تم تصور المستوى السفلي للنوى الاختزالية التي تحتوي على معقدات متشابكة داخل الغدد التناسلية Caenorhabditis elegans باستخدام تلطيخ HTP-3 و SYP-5.
تم حل محاور الكروموسوم في النهاية C ل SYP-5 HA بشكل جيد في جميع الأبعاد الثلاثة في مجمعات synaptonemal الموجودة بالقرب من غطاء الغطاء. ومع ذلك ، فإن الدقة تتدهور في مجمعات synaptonemal تقع على مسافة خمسة ميكرومتر من الغطاء بسبب تشتت الضوء والانحرافات الكروية. كشفت الصور التي تم الحصول عليها على مسافات بيزو مختلفة من غطاء الغطاء أن الأنسجة المصورة يجب ألا تزيد عن ميكرومترين من الغطاء.
يمكن أيضا استخدام بروتوكول تحضير العينة مع الفحص المجهري TauSTED. مع إعداد العينة الأمثل ، تم حل HTP-3 في محاور الكروموسوم و C-termini من SYP-5 في المنطقة الوسطى في الرؤية الأمامية والرؤية المائلة قليلا. للحصول على أفضل دقة ، يجب ربط الغدد التناسلية بإحكام بغطاء الغطاء للتأكد من أن مجمعات المشابك لا تبعد أكثر من ميكرومتر عن غطاء الغطاء.
نحن نستخدم هذا البروتوكول ليس فقط للفحص المجهري لتوطين جزيء واحد ، ولكن أيضا لفحص مجهر استنفاد الانبعاثات المحفز. قد يكون مفيدا أيضا لتقنيات الفحص المجهري فائقة الدقة الأخرى.
