El complejo sinaptonémico es un componente clave para la meiosis. Para estudiar su función, también debemos entender su estructura para la cual la microscopía de súper resolución ha resultado ser increíblemente útil. Hemos optimizado nuestro protocolo para unir de forma estable la gónada C.elegans inmunoteñida a un cubreobjetos que ayuda a mejorar la resolución hasta 30 nanómetros en tejidos intactos.
El diseño de experimentos de microscopía de localización de moléculas individuales, el análisis posterior y también la interpretación de los datos pueden ser bastante desafiantes y deberían configurarse mejor junto con un experto. Demostrando el procedimiento estará Ivana Cavka, becaria predoctoral en el laboratorio. La adquisición de las imágenes de microscopía de localización de molécula única también será mostrada por Rory Power, un ingeniero óptico en el MBL Imaging Center.
Comience recogiendo gusanos Caenorhabditis elegans de las placas de agar NGM. Transfiera los gusanos a una gota de 30 microlitros de EBTT en un cubreobjetos. Lave los gusanos con 30 microlitros adicionales de EBTT.
Retire 30 microlitros de la solución dejando una gota de 30 microlitros con los gusanos en el cubreobjetos. Use una hoja de bisturí para cortar las cabezas de los gusanos y / o las colas para extruir la gónada. En una disección exitosa, el tejido de las gónadas se extruirá completamente fuera del cuerpo del gusano.
Pipetear 30 microlitros de la solución fijadora en la gota de los gusanos disecados. Mezclar por pipeteo y dejar las muestras para fijar durante un minuto. Detenga la fijación exactamente después de un minuto transfiriendo los gusanos usando una pipeta de 20 microlitros a un tubo de PCR lleno de TBST.
Luego realice un lavado girando las muestras diseccionadas en una mini centrífuga de sobremesa. Una vez que se retire el sobrenadante, vuelva a suspender los gusanos en 200 microlitros de TBST fresco. Después del lavado final, resuspender los gusanos en 200 microlitros de PBST y colocar el tubo de PCR en hielo.
Gire las muestras diseccionadas en una mini centrífuga de sobremesa y retire el sobrenadante. Agregue de 50 a 100 microlitros de metanol frío, mezcle por pipeteo y deje las muestras en metanol durante 30 a 60 segundos en hielo. Lave las muestras dos veces con 200 microlitros de PBST.
Después de girar las muestras y retirar el sobrenadante, agregue la solución de bloqueo a las muestras y manténgala a temperatura ambiente durante 45 a 60 minutos. Diluir los anticuerpos primarios contra las soluciones de trabajo en el tampón de bloqueo. Gire las muestras en una mini centrífuga de sobremesa, retire la solución de bloqueo y agregue de 30 a 50 microlitros de la solución de anticuerpos primarios.
Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lavar las muestras tres veces en PBST. Diluya los dos fragmentos de Fab Prime etiquetados en las soluciones de trabajo en el búfer de bloqueo.
Después del tercer lavado, gire las muestras hacia abajo, retire el sobrenadante y agregue de 30 a 50 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios. Coloque la muestra en una cámara oscura e incube durante 30 minutos a dos horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego lave las muestras tres veces con PBST durante cinco a 15 minutos.
Gire las muestras manchadas y retire el sobrenadante. Agregue 50 microlitros de PBST y transfiera los gusanos manchados a un cubreobjetos. Pipetear de 5,7 a 6,3 microlitros de la solución postfijadora sobre un cubreobjetos de poli-l-lycine.
Pipetear los gusanos disecados en el mismo volumen y transferirlos a la gota de fijador en el cubreobjetos de poli-l-lisina. Cubra la muestra con un pequeño cubreobjetos. Retire el exceso de líquido con un pequeño trozo de papel de filtro y fije la muestra durante tres a cinco minutos en una cámara oscura.
Congele las muestras colocándolas en un bloque de aluminio en hielo seco. Después de al menos 20 minutos, retire el cubreobjetos más pequeño con una maquinilla de afeitar. Sumerja el cubreobjetos en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga PBS helado o metanol enfriado a menos 20 grados centígrados durante aproximadamente 10 segundos.
Coloque el cubreobjetos en un pocillo de una placa de seis pocillos llena de tampón PBST. Retire el PBST del pozo, agregue PBST fresco y deje la muestra durante cinco minutos. Después de lavar con PBST una vez más, deje las muestras a cuatro grados centígrados hasta que se obtengan imágenes.
Antes de obtener imágenes, evalúe la calidad del montaje de la muestra bajo un microscopio estéreo. Si utiliza el portamuestras hecho a medida que se muestra aquí, envuelva el anillo magnético con parafilm y luego prepare un mililitro de tampón de imágenes. Tome un cubreobjetos de la placa de seis pocillos.
Colóquelo en el soporte hecho a medida y fije el cubreobjetos en el soporte con el anillo magnético envuelto en parafilm. Pipetear suavemente el tampón de imágenes en la cámara creado por el anillo magnético en la parte superior de la muestra y sellar la cámara con parafilm. Para montar la muestra, agregue una gota de aceite de inmersión al objetivo de aceite limpio.
Sin introducir aire en el aceite de inmersión, coloque suavemente el portamuestras con la muestra montada en la platina del microscopio. Con la ventana del plug-in EMU de MicroManager 2, mueva la etapa piezoeléctrica hasta que se detecte la señal del láser de bloqueo de enfoque en el fotodiodo del cuadrante. Adquiera una imagen de plano focal posterior a menor potencia con un láser a 640 nanómetros de excitación para confirmar la ausencia de burbujas de aire en el aceite de inmersión.
Localice el tejido de la gónada utilizando la iluminación de campo claro. Usando una iluminación de baja intensidad a 640 nanómetros, concéntrese en la sección de tejido que contiene muchos complejos sinaptonemales. Proceda a exponer la muestra a alta irradiancia con iluminación a 640 nanómetros durante aproximadamente 30 segundos hasta que se logre una velocidad de parpadeo adecuada.
Adquiera 200.000 fotogramas con un tiempo de exposición de 20 milisegundos utilizando la herramienta de adquisición multidimensional de MicroManager 2. Mientras tanto, configure la activación UV utilizando la opción de activación del complemento EMU para mantener la velocidad de parpadeo deseada. El plano inferior de los núcleos meióticos que contienen complejos sinaptonemales se visualizó dentro de una gónada de Caenorhabditis elegans utilizando tinción HTP-3 y SYP-5.
Los ejes cromosómicos en el extremo C de SYP-5 HA estaban bien resueltos en las tres dimensiones en complejos sinaptonemales ubicados cerca del cubreobjetos. Sin embargo, la resolución se deteriora en complejos sinaptonemales ubicados a una distancia de cinco micrómetros del cubreobjetos debido a la dispersión de la luz y las aberraciones esféricas. Las imágenes adquiridas a diferentes distancias piezoeléctricas del cubreobjetos revelaron que el tejido fotografiado no debería estar a más de dos micrómetros del cubreobjetos.
El protocolo de preparación de muestras también se puede utilizar con microscopía TauSTED. Con la preparación optimizada de la muestra, HTP-3 en los ejes cromosómicos y los C-terminales de SYP-5 en la región central se resolvieron en vista frontal y vista ligeramente inclinada. Para obtener la mejor resolución, las gónadas deben estar reticuladas firmemente al cubreobjetos para garantizar que los complejos sinaptonemales no estén a más de dos micrómetros del cubreobjetos.
Utilizamos este protocolo no solo para microscopía de localización de moléculas individuales, sino también para microscopía de agotamiento por emisión estimulada. También puede ser útil para otras técnicas de microscopía de súper resolución.
