سيسمح هذا البروتوكول للباحثين ليس فقط بتبسيط خط أنابيب التحليل الخاص بهم ، ولكنه سيسمح لهم أيضا باستخراج المزيد من المعلومات من تيار عضويتهم ، وبالتالي تعزيز الأهمية الانتقالية. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يجمع بين سير عمل مبسط وخط تحليل آلي وذي صلة سريريا ، مما يمكن الباحثين من الحصول على كمية مقنعة من المعلومات من شاشة عضوية واحدة. يمكن استخدام هذه التقنية للتنبؤ باستجابة العلاج السريري لمرضى السرطان من فحوصات الأدوية العضوية خارج الجسم الحي مع نتائج مبكرة واعدة للغاية.
الهدف هو جعل منصة حلول البرمجيات محايدة بحيث يمكن للباحثين استخدام أداة تصوير الخلايا الحية المتاحة لهم. ابدأ بفصل عضويات الورم المشتقة من المريض إنزيميا ، أو PDTOs ، في المصفوفة خارج الخلية ، أو ECM ، القباب في الصفيحة الدقيقة المكونة من ستة آبار. لهذا ، قم أولا بشفط الوسط ، واغسل قباب ECM مرة واحدة باستخدام PBS.
ثم أضف ملليلتر من إنزيم التفكك في البئر. ماصة المحتوى لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام ماصة ملليلتر واحد لفصل المواد العضوية ميكانيكيا في القباب قبل احتضان اللوحة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، ماصة المحتوى لأعلى ولأسفل ، وتحقق من التفكك السليم للعضويات إلى خلايا مفردة باستخدام المجهر.
اجمع معلق الخلية في أنبوب سعة 15 ملليلتر ، واجعل الحجم يصل إلى 10 ملليلتر عن طريق إضافة ADF + Centrifuge الأنبوب عند 450 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، واستنشاق المادة الطافية باستخدام ماصة باستور ومضخة الشفط. أعد تعليق الحبيبات في 100 إلى 200 ميكرولتر من سرطان البنكرياس الغدي القنوي الكامل ، أو PDAC ، وسط الاستزراع العضوي اعتمادا على حجم الحبيبات قبل حساب عدد الخلايا باستخدام طريقة الاختيار. لطلاء الخلايا المفردة في قباب ECM ، قم بتخفيف الكمية المناسبة من تعليق الخلية عن طريق إضافة الكمية المطلوبة من ECM المذاب.
بعد ذلك ، ماصة تصل إلى 10 قطرات 20 ميكرولتر لكل بئر في لوحة من ستة آبار مسخنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية. اقلب اللوحة واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتراكب الآبار مع الوسط الكامل المكمل ب 10 ميكرومولار Y-27632 ، واحتضان لمدة يومين إلى ثلاثة أيام في حاضنة.
لحصاد المواد العضوية التي يتراوح عمرها يومين إلى ثلاثة أيام ، قم أولا بشفط الوسط ، واغسل الكائنات العضوية مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، أضف واحدا إلى ملليلتر من محلول الحصاد العضوي ، المبرد مسبقا إلى أربع درجات مئوية ، إلى بئر من لوحة الآبار الستة اعتمادا على عدد قباب ECM. احتضان لوحة أبقى على الجليد ، على منصة تهتز لمدة 10 دقائق.
الآن افصل قباب ECM عن طريق سحب المحتوى في الآبار لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة ملليلتر. مرة أخرى ، احتضان المواد العضوية لمدة 10 دقائق على الجليد قبل التأكد بصريا من تفكك قباب ECM تحت المجهر. اجمع المواد العضوية في أنبوب سعة 15 ملليلتر ، مغلف مسبقا بنسبة 0.1٪ BSA في PBS ، وقم بتكوين الحجم إلى 10 ملليلتر عن طريق إضافة ADF + Centrifuge الأنبوب عند 200 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات اعتمادا على حجمها بما يصل إلى ملليلتر واحد من وسط عضوي PDAC الكامل إلى التركيز العضوي النهائي المطلوب. افتح تطبيق التحكم في روبوت السحب ، وحدد البروتوكولات ، وانقر فوق استيراد قبل سحب وإسقاط الملف التكميلي 6 المقدم في الحقل المعين. حدد البروتوكول المستورد.
ووفقا للتخطيط الموضح في حقل إعداد سطح السفينة ، ضع جميع أدوات المختبر ، بما في ذلك عناصر التبريد والأدوات البلاستيكية ، في الطوابق. استخدم الفتحة اليسرى للخزان سعة 25 ملليلتر وعنصر التبريد. بعد ذلك ، انقر فوق تشغيل البروتوكول وانتقل إلى الإعداد.
افتح علامة التبويب إعداد Labware ، وانقر فوق تشغيل فحص موضع Labware ، واتبع التعليمات لمعايرة روبوت السحب إلى الجهاز الجديد. املأ الخزان سعة 25 ملليلتر ، الموجود أعلى عنصر التبريد ، بمحلول البذر العضوي المبرد ، وانقر فوق Start Run لوضع روبوت السحب في العمل. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للصفيحة الدقيقة بسرعة 100 جم لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية.
لإنشاء بروتوكول صرف الأدوية باستخدام برنامج التحكم الرقمي في موزع الأدوية ، مرر مؤشر الماوس فوق اللوحة 1 أعلى تخطيط اللوحة. حدد تحرير سمات اللوحة ، واملأ نوع اللوحة ك 384 بئرا ، والحجم الإضافي 50 ميكرولتر ، وحد DMSO ك 1٪ أضف السوائل بالنقر فوق زر الإضافة بجوار السوائل ، وانقر نقرا مزدوجا فوق السائل الذي تم إنشاؤه حديثا لتسميته. بعد ذلك ، حدد الفئة على أساس DMSO أو مائي بالإضافة إلى Tween 20 ، واملأ التركيز.
لإنشاء تخطيط اللوحة لمعايرة الدواء، حدد Wells وانقر على المعايرة. بالنسبة للسوائل ، حدد الدواء محل الاهتمام ، إلى جانب أعلى تركيز وأقل تركيز. بالنسبة للنسخ المتماثل، حدد اثنين على الأقل، واختر نمط المعايرة بالتحليل الحجمي المطلوب.
لإنشاء تخطيط اللوحة للتحكم الإيجابي ، حدد ثلاثة آبار ، وانقر فوق تعيين القيمة ، واملأ ستوروسبورين ثنائي الميكرومولار من مخزون 10 ملليمولار في DMSO للحث على أقصى موت للخلية. بالنسبة إلى Cytotox Green ، حدد جميع الآبار المستخدمة ، وانقر فوق تعيين القيمة ، وأدخل قيمة 60 نانومولار لكل بئر. للتحكم السلبي وتطبيع DMSO ، حدد جميع الآبار بأربعة آبار إضافية للتحكم في السيارة.
الآن انقر بزر الماوس الأيمن وحدد التطبيع قبل تعيين فئة السوائل الطبيعية على أساس DMSO. بعد ذلك ، قم بالتطبيع إلى أعلى حجم للفئة للحصول على تركيز DMSO متساو في كل بئر. بعد ذلك ، انقر فوق السهم الموجود أسفل Run في الزاوية اليسرى العليا ، وحدد Always Simulationate ، متبوعا بالنقر فوق محاكاة لتحديد أي أخطاء والحصول على أحجام كل دواء ليتم تحضيره.
الآن قم بإلغاء تحديد المحاكاة دائما تحت زر التشغيل قبل النقر فوق تشغيل لبدء بروتوكول صرف الأدوية ، واتبع التعليمات. ضع غشاء الختم على الصفيحة الدقيقة لمنع التبخر. افتح برنامج التحكم في تصوير الخلايا الحية ، وحدد محرر الطريقة جديد قبل الانتقال إلى ملف لاستيراد ملف XML للطريقة المثالية.
بدلا من ذلك ، اتبع التعليمات الموجودة في المخطوطة لإنشاء ملف جديد. ثم ، انقر فوق ابدأ لبدء المسح عند T0.To دمج البيانات وضغطها ، وإنشاء مجلد أصل جديد لنقل جميع مجلدات التجربة الفردية التي تم إنشاؤها لكل مسح ضوئي في كل نقطة زمنية بواسطة برنامج التحكم في تصوير الخلية الحية ، وقم بتسمية المجلدات المعنية باتباع الإرشادات الواردة في المخطوطة. قم بإعداد خريطة لوحة XLSX في برنامج التحكم الرقمي في موزع الأدوية عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على تخطيط خريطة اللوحة من بروتوكول صرف الأدوية ونسخ جميع الآبار للصق البيانات في ملف XLSX.
قم بإزالة بيانات Cytotox Green و staurosporine ، وأضف مصفوفة لخط الخلية ، وأدخل عنصر تحكم سلبي وتحكم إيجابي. افتح أداة ضغط البيانات. انقر فوق بحث ، وحدد المجلد الأصل ، وانقر فوق ضغط لبدء ضغط بيانات الصورة.
يتم ضغط جميع ملفات صور TIFF في HDF5 واحد لكل بئر في مجلد مجموعات بيانات جديد داخل المجلد الوالد. لتحليل الصور ، انتقل إلى النظام الأساسي لتطبيق الويب لتحليل الصور ، وقم بتسجيل الدخول ، وانقر فوق إضافة مشروع جديد في علامة التبويب الصفحة الرئيسية. أدخل اسم المشروع، واضغط على متابعة، وحدد إضافة تجربة جديدة قبل تحميل مجلد مجموعات البيانات الذي يحتوي على ملفات HDF5.
بعد التحميل ، انتقل إلى مجلد المشروع والتجربة للنقر فوق تحميل خريطة اللوحة للحصول على وظائف إضافية. ثم ، انقر بالتتابع فوق تشغيل التحليل ، وحدد تحليل متعدد الأعضاء ، والمعلمات الافتراضية ، وأخيرا تحليل لبدء تحليل الصورة. انقر فوق تنزيل النتائج لتنزيل جداول البيانات الأولية ، والتي تحتوي على قياسات كل بئر والصور أو مقاطع الفيديو المجزأة قبل التأكد من دقة التحليل لمزيد من معالجة البيانات.
لحساب الاختلافات في كثافة وحجم البذر العضوي ، تم استخدام المقاييس القائمة على معدل النمو لتقليل الاختلافات بين النسخ المتماثلة ، كما هو موضح في أشرطة الخطأ المخفضة. أظهرت صور التحكم السلبي ، والتحكم الإيجابي ، و PDTO المعالج بالجيمسيتابين وباكليتاكسيل أن العلاج الناجم في الغالب عن توقف النمو مع كمية محدودة من موت الخلايا ، بما يتوافق مع استجابة الدواء الطبيعية ، أو NDR ، قيمة أقل بقليل من الصفر. وعند استخدام خطين إضافيين، PDAC_052 و PDAC_087، لوحظ اختلاف واضح في معدل النمو بين الخطوط الثلاثة، مما يدعم استخدام مقاييس الموارد الوراثية.
أدت منحنيات الاستجابة للجرعة NDR إلى زيادة النطاق الديناميكي والفصل بين المرضى الثلاثة المختلفين ، مقارنة بمنحنيات GR. أظهر تحديد NDR بمرور الوقت أن PDAC_052 و PDAC_060 كان لديهم استجابة دوائية متشابهة جدا لجرعة منخفضة من gemcitabine-paclitaxel ، في حين يمكن ملاحظة استجابة تفاضلية واضحة للخلوي مقابل السامة للخلايا للجرعات المتوسطة والعالية المقابلة. كانت هذه الاستجابات الدوائية متسقة مع الاستجابات السريرية التي لوحظت في المرضى.
كشفت الديناميات النسيلية أن PDAC_087 كان لديه أكثر الحيوانات المستنسخة مقاومة بعد العلاج ، وهو ما يتوافق مع الطبيعة العدوانية للمرض الذي لوحظ في المريض ، والذي كان ، بشكل مثير للاهتمام ، الأقل حساسية للتحكم الإيجابي في staurosporin. يتمثل أهم جانب في البروتوكول في الحفاظ على تبريد جميع الحلول التي تحتوي على ECM أثناء البذر لأن التصلب غير الصحيح ل ECM يمكن أن يتداخل مع تحليل الصورة النهائية. يمكن أن تكون أتمتة عمل المختبر الرطب وتحليل الصور ومعالجة البيانات النهائية مفيدة لتسريع البحث وتحديد العلاجات المركبة الجديدة بسهولة أكبر.
