Este protocolo permitirá que os pesquisadores não apenas simplifiquem seu pipeline de análise, mas também lhes permitirá extrair mais informações de seu fluxo organoide, aumentando assim a relevância translacional. A principal vantagem deste protocolo é que ele combina um fluxo de trabalho simplificado com um pipeline de análise automatizado e clinicamente relevante, permitindo que os pesquisadores obtenham uma quantidade convincente de informações de uma única tela organoide. Esta técnica pode ser usada para prever a resposta da terapia clínica para pacientes com câncer a partir desses exames de drogas organoides ex vivo com resultados iniciais muito promissores.
O objetivo é tornar a plataforma de solução de software agnóstica para que os pesquisadores possam usar um instrumento de imagem de células vivas que esteja disponível para eles. Comece dissociando enzimaticamente os organoides tumorais derivados do paciente, ou PDTOs, nas cúpulas da matriz extracelular, ou ECM, na microplaca de seis poços. Para isso, primeiro aspirar o meio e lavar as cúpulas de ECM uma vez com PBS.
Em seguida, adicione dois mililitros da enzima de dissociação no poço. Pipete o conteúdo para cima e para baixo 10 vezes usando uma pipeta de um mililitro para dissociar mecanicamente os organoides nas cúpulas antes de incubar a placa por 10 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, pipete o conteúdo para cima e para baixo e verifique a dissociação adequada dos organoides em células individuais usando um microscópio.
Recolha a suspensão celular num tubo de 15 mililitros e aumente o volume até 10 mililitros adicionando ADF+Centrifugar o tubo a 450 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante utilizando uma pipeta Pasteur e uma bomba de sucção. Ressuspeite o pellet em 100 a 200 microlitros do adenocarcinoma ductal pancreático completo, ou PDAC, meio de cultura organoide, dependendo do tamanho do pellet, antes de contar o número de células usando um método de escolha. Para chapear as células individuais em cúpulas de ECM, diluir a quantidade apropriada de suspensão celular adicionando a quantidade necessária de ECM descongelada.
Em seguida, pipete até 10 gotículas de 20 microlitros por poço em uma placa de seis poços pré-aquecida a 37 graus Celsius. Inverter a placa e incubar durante 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, sobreponha os poços com o meio completo suplementado com 10 micromolares Y-27632 e incube por dois a três dias em uma incubadora.
Para colher os organoides de dois a três dias de idade, primeiro aspirar o meio e lavar os organoides uma vez com PBS. Em seguida, adicione um a dois mililitros de solução de colheita de organoides, pré-resfriada a quatro graus Celsius, a um poço da placa de seis poços, dependendo do número de cúpulas de ECM. Incubar a placa mantida no gelo, em uma plataforma de agitação por 10 minutos.
Agora dissocie as cúpulas de ECM pipetando o conteúdo nos poços para cima e para baixo com uma pipeta de um mililitro. Mais uma vez, incube os organoides por 10 minutos no gelo antes de confirmar visualmente a dissociação das cúpulas de ECM sob um microscópio. Recolher os organoides num tubo de 15 mililitros, pré-revestido com BSA a 0,1% em PBS, e completar o volume para 10 mililitros adicionando ADF+Centrifugar o tubo a 200 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet, dependendo do seu tamanho, em até um mililitro de meio organoide PDAC completo até a concentração organoide final desejada. Abra o aplicativo de controle do robô de pipetagem, selecione Protocolos e clique em Importar antes de arrastar e soltar o Arquivo Suplementar 6 fornecido no campo designado. Selecione o protocolo importado.
E de acordo com o layout mostrado no campo Configuração do convés, coloque todos os materiais de laboratório, incluindo elementos de resfriamento e plásticos, nos decks. Use o slot esquerdo para o reservatório de 25 mililitros e o elemento de resfriamento. Em seguida, clique em Executar protocolo e prossiga para a instalação.
Abra a guia Configuração do Labware, clique em Executar verificação de posição do Labware e siga as instruções para calibrar o robô de pipetagem para o novo hardware. Encha o reservatório de 25 mililitros, colocado em cima do elemento de resfriamento, com a solução de semeadura organoide resfriada e clique em Iniciar execução para colocar o robô de pipetagem em ação. Em seguida, centrifugar a microplaca a uma velocidade de 100 g por um minuto a quatro graus Celsius.
Para criar o protocolo de dispensação de medicamentos usando o software de controle de dispensador de medicamentos digital, passe o mouse sobre a Placa 1 acima do layout da placa. Selecione Editar atributos da placa e preencha o tipo de placa como 384 poços, o volume adicional como 50 microlitros e o limite DMSO como 1%Adicionar fluidos clicando no botão de adição ao lado de Fluidos e clique duas vezes no fluido recém-criado para nomeá-lo. Em seguida, selecione a classe como baseada em DMSO ou aquosa mais Tween 20 e preencha a concentração.
Para criar o layout da placa para titulação de drogas, selecione Wells e clique em Titulação. Para o fluido, selecione a droga de interesse, juntamente com a maior concentração desejada e a menor concentração. Para replicações, selecione um mínimo de duas e escolha o padrão de titulação desejado.
Para criar o layout da placa para o controle positivo, selecione três poços, clique em Definir Valor e preencha a estaurosporina de dois micromolares de um estoque de 10 milimolares em DMSO para induzir a morte celular máxima. Para Cytotox Green, selecione todos os poços usados, clique em Definir Valor e insira um valor de 60 nanomolares por poço. Para o controle negativo e normalização DMSO, selecione todos os poços com quatro poços adicionais para o controle do veículo.
Agora clique com o botão direito do mouse e selecione Normalização antes de atribuir a classe de fluido normalizada como baseada em DMSO. Em seguida, normalize para o volume de classe mais alta para obter uma concentração igual de DMSO em cada poço. Em seguida, clique na seta em Executar, no canto superior esquerdo, e selecione Sempre Simular, seguido de clicar em Simular para identificar quaisquer erros e obter os volumes de cada medicamento a ser preparado.
Agora desmarque Sempre Simular no botão Executar antes de clicar em Executar para iniciar o protocolo de dispensação de medicamentos e siga as instruções. Aplique a membrana de vedação na microplaca para evitar a evaporação. Abra o software de controle do gerador de imagens de célula dinâmica e selecione Editor de Método Novo antes de ir para Arquivo para importar o arquivo XML do método de exemplo.
Como alternativa, siga as instruções no manuscrito para criar um novo arquivo. Em seguida, clique em Iniciar para iniciar a digitalização em T0.To mesclar e compactar os dados, criar uma nova pasta pai para transferir todas as pastas experimentais individuais geradas para cada varredura em cada ponto de tempo pelo software de controle de imageador de células vivas e nomear as respectivas pastas seguindo as instruções dadas no manuscrito. Prepare um mapa de placas XLSX no software de controle de dispensador de medicamentos digital clicando com o botão direito do mouse no layout do mapa de placas do protocolo de dispensação de medicamentos e copiando todos os poços para colar os dados em um arquivo XLSX.
Remova os dados de Cytotox Green e estaurosporina, adicione uma matriz para a linhagem celular e insira um controle negativo e um controle positivo. Abra a Ferramenta de Compactação de Dados. Clique em Pesquisar, selecione a pasta pai e clique em Compactar para iniciar a compactação de dados de imagem.
Todos os arquivos de imagem TIFF são compactados em um único HDF5 para cada poço em uma nova pasta de conjuntos de dados dentro da pasta parental. Para analisar as imagens, vá para a plataforma do aplicativo Web de análise de imagens, faça login e clique em Adicionar Novo Projeto na guia Página Inicial. Insira o nome do projeto, pressione Continuar e selecione Adicionar novo experimento antes de carregar a pasta de conjuntos de dados que contém os arquivos HDF5.
Após o upload, vá para a pasta do projeto e do experimento para clicar em Upload Plate Map para obter funcionalidades adicionais. Em seguida, clique sequencialmente em Executar Análise, selecione Análise Multi-Organóide, Parâmetros Padrão e, finalmente, Analisar para iniciar a análise de imagem. Clique em Download Results para baixar as tabelas de dados brutos, que contêm as medições para cada poço e as imagens ou vídeos segmentados antes de confirmar a precisão da análise para processamento de dados posteriores.
Para explicar as variações na densidade e tamanho da semeadura de organoides, métricas baseadas na taxa de crescimento foram usadas para reduzir as variações entre as replicações, conforme indicado pelas barras de erro reduzidas. As imagens para o controle negativo, o controle positivo e a PDTO combinada tratada com gemcitabina e paclitaxel mostraram que a terapia induziu predominantemente a parada do crescimento com uma quantidade limitada de morte celular, correspondendo à resposta medicamentosa normalizada, ou NDR, valor pouco abaixo de zero. Ao utilizar duas linhas adicionais, PDAC_052 e PDAC_087, observou-se uma clara diferença na taxa de crescimento entre as três linhas, apoiando o uso de métricas de GR.
As curvas dose-resposta da NDR resultaram em um aumento da faixa dinâmica e da separação entre os três pacientes diferentes, em comparação com as curvas GR. A determinação da NDR ao longo do tempo mostrou que PDAC_052 e PDAC_060 tiveram uma resposta citostática muito semelhante a uma dose baixa de gemcitabina-paclitaxel, enquanto uma clara resposta citostática diferencial versus citotóxica pôde ser observada para as doses médias e altas correspondentes. Essas respostas medicamentosas foram consistentes com as respostas clínicas observadas nos pacientes.
A dinâmica clonal revelou que PDAC_087 apresentaram os subclones mais resistentes após o tratamento, o que é consistente com a natureza agressiva da doença observada no paciente, que, curiosamente, também foi o menos sensível à estaurosporina de controle positivo. O aspecto mais importante do protocolo é manter todas as soluções contendo ECM resfriadas durante a semeadura, pois a solidificação incorreta da ECM pode interferir na análise da imagem a jusante. A automação do trabalho de laboratório úmido, a análise de imagens e o processamento de dados a jusante podem ser úteis para acelerar a pesquisa e identificar novas terapias combinadas com mais facilidade.
