이 프로토콜을 통해 연구원은 분석 파이프라인을 간소화할 수 있을 뿐만 아니라 오가노이드 스트림에서 더 많은 정보를 추출하여 번역 관련성을 높일 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 간소화된 워크플로우와 자동화되고 임상적으로 관련된 분석 파이프라인을 결합하여 연구자가 하나의 단일 오가노이드 스크린에서 강력한 양의 정보를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 기술은 매우 유망한 초기 결과로 이러한 생체 외 오가노이드 약물 스크리닝에서 암 환자의 임상 치료 반응을 예측하는 데 사용할 수 있습니다.
목표는 소프트웨어 솔루션 플랫폼을 애그노스틱하게 만들어 연구원들이 사용할 수 있는 라이브 셀 이미징 기기를 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 6웰 마이크로플레이트의 세포외 기질 또는 ECM 돔에서 환자 유래 종양 오가노이드(PDTO)를 효소적으로 해리하는 것으로 시작합니다. 이를 위해 먼저 매체를 흡입하고 ECM 돔을 PBS로 한 번 씻으십시오.
그런 다음 우물에 2 밀리리터의 해리 효소를 넣으십시오. 1 밀리리터 피펫을 사용하여 내용물을 위아래로 10 번 피펫하여 돔의 유기체를 기계적으로 해리 한 후 섭씨 37도에서 10 분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후, 내용물을 위아래로 피펫팅하고, 현미경을 사용하여 단일 세포에 대한 오가노이드의 적절한 해리를 확인합니다.
15 밀리리터 튜브에 세포 현탁액을 모으고 ADF + 원심 분리기를 추가하여 실온에서 5 분 동안 450g으로 튜브를 10 밀리리터까지 부피를 만들고 파스퇴르 피펫과 흡입 펌프를 사용하여 상청액을 흡인합니다. 선택한 방법을 사용하여 세포 수를 계수하기 전에 펠렛의 크기에 따라 전체 췌관 선암 또는 PDAC, 오가노이드 배양 배지의 100 내지 200 마이크로리터에 펠렛을 재현탁시킨다. ECM 돔에서 단일 세포를 플레이팅하려면 필요한 양의 해동된 ECM을 추가하여 적절한 양의 세포 현탁액을 희석합니다.
그런 다음 섭씨 37도로 예열된 6웰 플레이트에서 웰당 최대 10개의 20마이크로리터 방울을 피펫팅합니다. 플레이트를 뒤집고 섭씨 37도에서 30 분 동안 배양하십시오. 다음으로, 10- 마이크로 몰 Y-27632가 보충 된 전체 배지로 웰을 오버레이하고 인큐베이터에서 2-3 일 동안 배양하십시오.
2-3일된 오가노이드를 수확하려면 먼저 배지를 흡인하고 PBS로 오가노이드를 한 번 세척합니다. 그런 다음 ECM 돔의 수에 따라 섭씨 4도까지 사전 냉각된 1-2밀리리터의 오가노이드 수확 용액을 6웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 얼음 위에 보관 된 접시를 흔들리는 플랫폼에서 10 분 동안 배양하십시오.
이제 1 밀리리터 피펫으로 웰의 내용물을 위아래로 피펫팅하여 ECM 돔을 분리합니다. 다시 한 번, 현미경으로 ECM 돔의 해리를 육안으로 확인하기 전에 얼음 위에서 10분 동안 오가노이드를 배양합니다. PBS에 0.1%BSA로 사전 코팅된 15밀리리터 튜브에 오가노이드를 수집하고 ADF+Centrifuge를 추가하여 튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 200g으로 추가하여 부피를 10밀리리터로 구성합니다.
다음으로, 상청액을 흡인하고, 그의 크기에 따라 펠렛을 최대 1 밀리리터의 전체 PDAC 오가노이드 배지에 원하는 최종 오가노이드 농도로 재현탁시킨다. 파이펫팅 로봇 제어 어플리케이션을 열고 프로토콜을 선택한 다음 제공된 보조 파일 6을 지정된 필드로 끌어다 놓기 전에 가져오기를 클릭합니다. 가져온 프로토콜을 선택합니다.
그리고 데크 설정 필드에 표시된 레이아웃에 따라 냉각 요소와 플라스틱 제품을 포함한 모든 실험기구를 데크에 배치합니다. 왼쪽 슬롯을 25 밀리리터 저장소 및 냉각 요소로 사용하십시오. 그런 다음 프로토콜 실행을 클릭하고 설정을 진행합니다.
실험기구 설정 탭을 열고 실험기구 위치 확인 실행을 클릭한 다음 지침에 따라 피펫팅 로봇을 새 하드웨어에 맞게 교정합니다. 냉각 요소 위에 놓인 25밀리리터 저장소를 냉각된 오가노이드 파종 용액으로 채우고 Start Run(실행 시작)을 클릭하여 피펫팅 로봇을 작동시킵니다. 다음으로, 마이크로플레이트를 섭씨 4도에서 1분 동안 100g의 속도로 원심분리한다.
디지털 약물 디스펜서 제어 소프트웨어를 사용하여 약물 디스펜싱 프로토콜을 생성하려면 플레이트 레이아웃 위의 플레이트 1 위로 마우스를 가져갑니다. 플레이트 속성 편집을 선택하고 유체 옆에 있는 추가 버튼을 클릭하여 플레이트 유형을 384웰로, 추가 부피를 50마이크로리터로, DMSO 제한을 1%유체 추가로, 새로 생성된 유체를 두 번 클릭하여 이름을 지정합니다. 이어서, 클래스를 DMSO 기반 또는 수성 플러스 트윈 20으로 선택하고, 농도를 채운다.
약물 적정을 위한 플레이트 레이아웃을 생성하려면 Wells를 선택하고 적정을 클릭합니다. 유체의 경우 원하는 최고 농도 및 최저 농도와 함께 관심 약물을 선택하십시오. 반복실험의 경우 최소 2개를 선택하고 원하는 적정 패턴을 선택합니다.
양성 대조군에 대한 플레이트 레이아웃을 만들려면 3개의 웰을 선택하고 Set Value를 클릭한 다음 DMSO의 10밀리몰 스톡에서 2마이크로몰 스타우로스포린을 채워 최대 세포 사멸을 유도합니다. Cytotox Green의 경우 사용된 모든 웰을 선택하고 값 설정을 클릭한 다음 웰당 60나노몰 값을 입력합니다. 음성 대조군 및 DMSO 정규화의 경우, 비히클 대조군을 위한 추가 4개의 웰이 있는 모든 웰을 선택한다.
이제 정규화된 유체 클래스를 DMSO 기반으로 할당하기 전에 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 정규화를 선택합니다. 이어서, 최고 클래스 부피로 정규화하여 각각의 웰에서 동일한 DMSO 농도를 얻는다. 그런 다음 왼쪽 상단 모서리에 있는 실행 아래의 화살표를 클릭하고 항상 시뮬레이션을 선택한 다음 시뮬레이션을 클릭하여 오류를 식별하고 준비할 각 약물의 양을 얻습니다.
이제 실행을 클릭하여 약물 분배 프로토콜을 시작하기 전에 실행 버튼 아래의 항상 시뮬레이션을 선택 취소하고 지침을 따르십시오. 증발을 방지하기 위해 밀봉 멤브레인을 마이크로 플레이트에 적용하십시오. 라이브 셀 이미저 제어 소프트웨어를 열고 메서드 편집기 새로 만들기를 선택한 다음 파일로 이동하여 예제 메서드 XML 파일을 가져옵니다.
또는 원고의 지침에 따라 새 파일을 만듭니다. 그런 다음 시작을 클릭하여 데이터를 병합 및 압축 T0.To 스캔을 시작하고, 라이브 셀 이미저 제어 소프트웨어에 의해 각 시점에서 각 스캔에 대해 생성된 모든 개별 실험 폴더를 전송하기 위한 새 상위 폴더를 만들고, 원고에 제공된 지침에 따라 각 폴더의 이름을 지정합니다. 약물 분배 프로토콜에서 플레이트 맵 레이아웃을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 모든 웰을 복사하여 XLSX 파일에 데이터를 붙여넣어 디지털 약물 디스펜서 제어 소프트웨어에서 XLSX 플레이트 맵을 준비합니다.
Cytotox Green 및 스타우로스포린 데이터를 제거하고, 세포주에 대한 매트릭스를 추가하고, 음성 대조군과 양성 대조군을 입력합니다. 데이터 압축 도구를 엽니다. 검색을 클릭하고 상위 폴더를 선택한 다음 압축을 클릭하여 이미지 데이터 압축을 시작합니다.
모든 TIFF 이미지 파일은 상위 폴더 내의 새 데이터 세트 폴더에 있는 각 웰에 대해 단일 HDF5로 압축됩니다. 이미지를 분석하려면 이미지 분석 웹 앱 플랫폼으로 이동하여 로그인하고 홈 탭에서 새 프로젝트 추가를 클릭합니다. 프로젝트 이름을 입력하고 계속을 누른 다음 새 실험 추가를 선택한 다음 HDF5 파일이 포함된 데이터 세트 폴더를 업로드합니다.
업로드 후 프로젝트 및 실험 폴더로 이동하여 플레이트 맵 업로드를 클릭하여 추가 기능을 확인합니다. 그런 다음 분석 실행을 순차적으로 클릭하고 다중 오가노이드 분석, 기본 매개 변수를 선택하고 마지막으로 분석을 선택하여 이미지 분석을 시작합니다. 추가 데이터 처리를 위해 분석의 정확성을 확인하기 전에 각 웰에 대한 측정값과 분할된 이미지 또는 비디오가 포함된 원시 데이터 테이블을 다운로드하려면 결과 다운로드를 클릭합니다.
오가노이드 파종 밀도와 크기의 변화를 설명하기 위해 감소된 오차 막대로 표시된 대로 반복실험 간의 변동을 줄이기 위해 성장률 기반 메트릭을 사용했습니다. 음성 대조군, 양성 대조군 및 젬시타빈과 파클리탁셀 처리된 PDTO의 조합에 대한 이미지는 요법이 0 바로 아래의 정규화된 약물 반응 또는 NDR에 해당하는 제한된 양의 세포 사멸로 주로 성장 정지를 유도했음을 보여주었습니다. PDAC_052 및 PDAC_087의 두 개의 추가 라인을 사용하면 세 라인 간의 성장률에 명확한 차이가 관찰되어 GR 메트릭 사용을 뒷받침했습니다.
NDR 용량-반응 곡선은 GR 곡선과 비교하여 세 명의 다른 환자 간의 동적 범위와 분리를 증가시켰습니다. 시간 경과에 따른 NDR의 측정은 PDAC_052 및 PDAC_060가 저용량의 젬시타빈-파클리탁셀에 대해 매우 유사한 세포증식 억제 약물 반응을 갖는 반면, 상응하는 중간 및 고용량에 대해 명확한 차등 세포증식 억제 대 세포독성 반응이 관찰될 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 약물 반응은 환자에서 관찰된 임상 반응과 일치하였다.
클론 역학은 치료 후 PDAC_087 가장 내성이 강한 서브클론을 가지고 있음을 밝혀 냈으며, 이는 흥미롭게도 양성 대조군 staurosporin에 가장 덜 민감한 환자에서 관찰 된 질병의 공격적인 특성과 일치합니다. 프로토콜의 가장 중요한 측면은 ECM의 잘못된 응고가 다운스트림 이미지 분석을 방해할 수 있기 때문에 시드 중에 ECM이 포함된 모든 솔루션을 냉각된 상태로 유지하는 것입니다. 습식 실험실 작업의 자동화, 이미지 분석 및 다운스트림 데이터 처리는 연구를 가속화하고 새로운 조합 요법을 보다 쉽게 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
