Ce protocole permettra aux chercheurs non seulement de rationaliser leur pipeline d’analyse, mais il leur permettra également d’extraire plus d’informations de leur flux organoïde, améliorant ainsi la pertinence translationnelle. Le principal avantage de ce protocole est qu’il combine un flux de travail rationalisé avec un pipeline d’analyse automatisé et cliniquement pertinent, permettant ainsi aux chercheurs d’obtenir une quantité convaincante d’informations à partir d’un seul écran organoïde. Cette technique peut être utilisée pour prédire la réponse thérapeutique clinique des patients cancéreux à partir de ces criblages de médicaments organoïdes ex vivo avec des résultats précoces très prometteurs.
L’objectif est de rendre la plate-forme de solution logicielle agnostique afin que les chercheurs puissent utiliser un instrument d’imagerie de cellules vivantes à leur disposition. Commencez par dissocier enzymatiquement les organoïdes tumoraux dérivés du patient, ou PDTO, dans les dômes de la matrice extracellulaire, ou ECM, dans la microplaque à six puits. Pour cela, aspirez d’abord le milieu et lavez les dômes ECM une fois avec du PBS.
Ensuite, ajoutez deux millilitres de l’enzyme de dissociation dans le puits. Pipeter le contenu de haut en bas 10 fois à l’aide d’une pipette d’un millilitre pour dissocier mécaniquement les organoïdes dans les dômes avant d’incuber la plaque pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, pipeter le contenu de haut en bas et vérifier la bonne dissociation des organoïdes en cellules individuelles à l’aide d’un microscope.
Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et porter le volume jusqu’à 10 millilitres en ajoutant ADF + centrifuger le tube à 450 g pendant cinq minutes à température ambiante, et aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur et d’une pompe d’aspiration. Remettez la pastille en suspension dans 100 à 200 microlitres de l’adénocarcinome canalaire pancréatique complet, ou PDAC, milieu de culture organoïde selon la taille de la pastille avant de compter le nombre de cellules en utilisant une méthode de choix. Pour plaquer les cellules individuelles dans des dômes ECM, diluez la quantité appropriée de suspension cellulaire en ajoutant la quantité requise d’ECM décongelée.
Ensuite, pipeter jusqu’à 10 gouttelettes de 20 microlitres par puits dans une plaque de six puits préchauffée à 37 degrés Celsius. Retourner la plaque et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, superposez les puits avec le milieu complet complété par du Y-27632 10 micromolaires et incuber pendant deux à trois jours dans un incubateur.
Pour récolter les organoïdes âgés de deux à trois jours, aspirez d’abord le milieu et lavez les organoïdes une fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez un à deux millilitres de solution de récolte organoïde, pré-refroidie à quatre degrés Celsius, à un puits de la plaque de six puits en fonction du nombre de dômes ECM. Incuber l’assiette maintenue sur la glace, sur une plate-forme tremblante pendant 10 minutes.
Maintenant, dissociez les dômes ECM en pipetant le contenu dans les puits de haut en bas avec une pipette d’un millilitre. Encore une fois, incuber les organoïdes pendant 10 minutes sur de la glace avant de confirmer visuellement la dissociation des dômes ECM au microscope. Recueillir les organoïdes dans un tube de 15 millilitres, pré-enduit de 0,1% de BSA dans du PBS, et porter le volume à 10 millilitres en ajoutant ADF + centrifugeuse le tube à 200 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Ensuite, aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension en fonction de sa taille dans un millilitre de milieu organoïde PDAC complet jusqu’à la concentration organoïde finale souhaitée. Ouvrez l’application de contrôle du robot de pipetage, sélectionnez Protocoles et cliquez sur Importer avant de glisser-déposer le fichier supplémentaire 6 fourni dans le champ désigné. Sélectionnez le protocole importé.
Et selon la disposition indiquée dans le champ Configuration du pont, placez tous les articles de laboratoire, y compris les éléments de refroidissement et les articles en plastique, dans les ponts. Utilisez la fente gauche pour le réservoir de 25 millilitres et l’élément de refroidissement. Ensuite, cliquez sur Exécuter le protocole et passez à la configuration.
Ouvrez l’onglet Labware Setup (Configuration du logiciel Labware), cliquez sur Run Labware Position Check (Exécuter la vérification de la position du Labware) et suivez les instructions pour calibrer le robot de pipetage sur le nouveau matériel. Remplissez le réservoir de 25 millilitres, placé au-dessus de l’élément de refroidissement, avec la solution d’ensemencement organoïde refroidie, puis cliquez sur Démarrer l’exécution pour mettre le robot de pipetage en action. Ensuite, centrifugez la microplaque à une vitesse de 100 g pendant une minute à quatre degrés Celsius.
Pour créer le protocole de distribution de médicaments à l’aide du logiciel de contrôle numérique des distributeurs de médicaments, passez la souris sur la plaque 1 au-dessus de la disposition de la plaque. Sélectionnez Modifier les attributs de la plaque et remplissez le type de plaque comme puits 384, le volume supplémentaire comme 50 microlitres et la limite DMSO comme 1%Ajouter des fluides en cliquant sur le bouton d’ajout à côté de Fluides, et double-cliquez sur le fluide nouvellement créé pour le nommer. Ensuite, sélectionnez la classe à base de DMSO ou aqueuse plus Tween 20, et remplissez la concentration.
Pour créer la disposition des plaques pour le titrage des médicaments, sélectionnez Wells et cliquez sur Titrage. Pour le liquide, sélectionnez le médicament d’intérêt, ainsi que la concentration la plus élevée et la concentration la plus faible souhaitées. Pour les réplications, sélectionnez un minimum de deux et choisissez le modèle de titrage souhaité.
Pour créer la disposition de la plaque pour le témoin positif, sélectionnez trois puits, cliquez sur Définir la valeur et remplissez la staurosporine à deux micromolaires à partir d’un stock de 10 millimolaires en DMSO pour induire une mort cellulaire maximale. Pour Cytotox Green, sélectionnez tous les puits utilisés, cliquez sur Définir la valeur et entrez une valeur de 60 nanomolaires par puits. Pour le contrôle négatif et la normalisation DMSO, sélectionnez tous les puits avec quatre puits supplémentaires pour le contrôle du véhicule.
Maintenant, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Normalisation avant d’affecter la classe de fluide normalisée comme DMSO. Ensuite, normalisez au volume de classe le plus élevé pour obtenir une concentration égale de DMSO dans chaque puits. Ensuite, cliquez sur la flèche sous Exécuter dans le coin supérieur gauche, puis sélectionnez Toujours simuler, puis cliquez sur Simuler pour identifier les erreurs et obtenir les volumes de chaque médicament à préparer.
Maintenant, décochez Toujours simuler sous le bouton Exécuter avant de cliquer sur Exécuter pour démarrer le protocole de distribution du médicament et suivez les instructions. Appliquez la membrane d’étanchéité sur la microplaque pour éviter l’évaporation. Ouvrez le logiciel de contrôle de l’imageur de cellule vivante et sélectionnez Éditeur de méthode Nouveau avant d’accéder à Fichier pour importer l’exemple de fichier XML de méthode.
Vous pouvez également suivre les instructions du manuscrit pour créer un nouveau fichier. Ensuite, cliquez sur Démarrer pour lancer l’analyse à T0.To fusionnez et compressez les données, créez un nouveau dossier parent pour transférer tous les dossiers d’expérience individuels générés pour chaque numérisation à chaque point de temps par le logiciel de contrôle de l’imageur de cellule vivante et nommez les dossiers respectifs en suivant les instructions données dans le manuscrit. Préparez une carte de plaque XLSX dans le logiciel de contrôle numérique des distributeurs de médicaments en cliquant avec le bouton droit de la souris sur la disposition de la carte des plaques à partir du protocole de distribution de médicaments et en copiant tous les puits pour coller les données dans un fichier XLSX.
Supprimez les données de Cytotox Green et de staurosporine, ajoutez une matrice pour la lignée cellulaire et entrez dans un contrôle négatif et un contrôle positif. Ouvrez l’outil de compression de données. Cliquez sur Rechercher, sélectionnez le dossier parent, puis cliquez sur Compresser pour lancer la compression des données d’image.
Tous les fichiers image TIFF sont compressés en un seul HDF5 pour chaque puits dans un nouveau dossier de jeux de données dans le dossier parental. Pour analyser les images, accédez à la plateforme d’application Web d’analyse d’images, connectez-vous et cliquez sur Ajouter un nouveau projet dans l’onglet Accueil. Entrez le nom du projet, appuyez sur Continuer et sélectionnez Ajouter une nouvelle expérience avant de télécharger le dossier des jeux de données contenant les fichiers HDF5.
Après le téléchargement, accédez au dossier du projet et de l’expérience pour cliquer sur Télécharger la carte des plaques pour obtenir des fonctionnalités supplémentaires. Ensuite, cliquez séquentiellement sur Exécuter l’analyse, sélectionnez Analyse multi-organoïde, Paramètres par défaut et enfin Analyser pour lancer l’analyse d’image. Cliquez sur Télécharger les résultats pour télécharger les tableaux de données brutes, qui contiennent les mesures pour chaque puits et les images ou vidéos segmentées avant de confirmer l’exactitude de l’analyse pour un traitement ultérieur des données.
Pour tenir compte des variations de la densité et de la taille des semis organoïdes, des paramètres basés sur le taux de croissance ont été utilisés pour réduire les variations entre les répétitions, comme l’indiquent les barres d’erreur réduites. Les images du témoin négatif, du témoin positif et de la PDTO combinée traitée par gemcitabine et paclitaxel ont montré que le traitement induisait principalement un arrêt de la croissance avec une quantité limitée de mort cellulaire, correspondant à une valeur de réponse médicamenteuse normalisée, ou NDR, juste en dessous de zéro. En utilisant deux lignes supplémentaires, PDAC_052 et PDAC_087, une nette différence de taux de croissance entre les trois lignes a été observée, ce qui appuie l’utilisation de mesures GR.
Les courbes dose-réponse NDR ont entraîné une augmentation de la plage dynamique et de la séparation entre les trois patients différents, par rapport aux courbes GR. La détermination du NDR au fil du temps a montré que PDAC_052 et PDAC_060 avaient une réponse cytostatique très similaire à une faible dose de gemcitabine-paclitaxel, tandis qu’une réponse cytostatique par rapport à cytotoxique différentielle claire pouvait être observée pour les doses moyennes et élevées correspondantes. Ces réponses médicamenteuses étaient cohérentes avec les réponses cliniques observées chez les patients.
La dynamique clonale a révélé que PDAC_087 avait les sous-clones les plus résistants après le traitement, ce qui est cohérent avec la nature agressive de la maladie observée chez le patient, qui, fait intéressant, était également le moins sensible à la staurosporine témoin positive. L’aspect le plus important du protocole est de garder toutes les solutions contenant de l’ECM refroidies pendant l’ensemencement car une solidification incorrecte de l’ECM peut interférer avec l’analyse des images en aval. L’automatisation du travail de laboratoire humide, l’analyse d’images et le traitement des données en aval peuvent être utiles pour accélérer la recherche et identifier plus facilement de nouvelles thérapies combinées.
