Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern nicht nur, ihre Analysepipeline zu rationalisieren, sondern auch mehr Informationen aus ihrem Organoidstrom zu extrahieren und so die translationale Relevanz zu erhöhen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es einen optimierten Workflow mit einer automatisierten und klinisch relevanten Analyse-Pipeline kombiniert, wodurch Forscher eine überzeugende Menge an Informationen aus einem einzigen Organoid-Screen erhalten können. Diese Technik kann verwendet werden, um das klinische Ansprechen auf die Therapie von Krebspatienten aus diesen ex vivo Organoid-Wirkstoff-Screenings mit sehr vielversprechenden frühen Ergebnissen vorherzusagen.
Ziel ist es, die Softwarelösungsplattform agnostisch zu machen, so dass Forscher ein Live-Cell-Imaging-Instrument verwenden können, das ihnen zur Verfügung steht. Beginnen Sie mit der enzymatischen Dissoziation der vom Patienten abgeleiteten Tumororganoide (PDTOs) in den extrazellulären Matrix- oder ECM-Kuppeln in der Mikroplatte mit sechs Vertiefungen. Dazu saugen Sie zuerst das Medium ab und waschen Sie die ECM-Kuppeln einmal mit PBS.
Dann fügen Sie zwei Milliliter des Dissoziationsenzyms in die Vertiefung ein. Pipettieren Sie den Inhalt 10 Mal mit einer Ein-Milliliter-Pipette, um die Organoide in den Kuppeln mechanisch zu dissoziieren, bevor Sie die Platte für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation pipettieren Sie den Inhalt auf und ab und prüfen Sie mit einem Mikroskop die korrekte Dissoziation der Organoide zu einzelnen Zellen.
Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Röhrchen und erhöhen Sie das Volumen auf 10 Milliliter durch Zugabe von ADF+Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 450 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und saugen Sie den Überstand mit einer Pasteur-Pipette und einer Absaugpumpe ab. Resuspendieren Sie das Pellet in 100 bis 200 Mikrolitern des vollständigen duktalen Pankreas-Adenokarzinoms oder PDAC-Organoid-Kulturmediums, abhängig von der Größe des Pellets, bevor Sie die Anzahl der Zellen mit einer Methode der Wahl zählen. Um die einzelnen Zellen in ECM-Domen zu plattieren, verdünnen Sie die entsprechende Menge an Zellsuspension, indem Sie die erforderliche Menge an aufgetautem ECM hinzufügen.
Dann pipettieren Sie bis zu 10 20-Mikroliter-Tröpfchen pro Vertiefung in einer auf 37 Grad Celsius vorgeheizten Platte mit sechs Vertiefungen. Drehen Sie die Platte um und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Als nächstes überlagern Sie die Vertiefungen mit dem vollen Medium, das mit 10-Mikromolar Y-27632 ergänzt ist, und inkubieren Sie für zwei bis drei Tage in einem Inkubator.
Um die zwei bis drei Tage alten Organoide zu ernten, saugen Sie zuerst das Medium ab und waschen Sie die Organoide einmal mit PBS. Dann geben Sie ein bis zwei Milliliter Organoid-Erntelösung, vorgekühlt auf vier Grad Celsius, in eine Vertiefung der Sechs-Well-Platte, abhängig von der Anzahl der ECM-Kuppeln. Inkubieren Sie die Platte auf Eis auf einer Schüttelplattform für 10 Minuten.
Trennen Sie nun die ECM-Doms, indem Sie den Inhalt in den Vertiefungen mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie die Organoide erneut für 10 Minuten auf Eis, bevor Sie die Dissoziation der ECM-Domen unter einem Mikroskop visuell bestätigen. Sammeln Sie die Organoide in einem 15-Milliliter-Röhrchen, das mit 0,1% BSA in PBS vorbeschichtet ist, und füllen Sie das Volumen auf 10 Milliliter auf, indem Sie ADF+Zentrifuge das Röhrchen bei 200 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius auffüllen.
Und gemäß dem Layout, das im Feld Deck-Setup angezeigt wird, platzieren Sie alle Laborgeräte, einschließlich Kühlelemente und Kunststoffwaren, in den Decks. Verwenden Sie den linken Steckplatz für den 25-Milliliter-Behälter und das Kühlelement. Klicken Sie anschließend auf Protokoll ausführen und fahren Sie mit dem Setup fort.
Öffnen Sie die Registerkarte Labware-Setup, klicken Sie auf Labware-Positionsprüfung ausführen und folgen Sie den Anweisungen, um den Pipettierroboter auf die neue Hardware zu kalibrieren. Füllen Sie den 25-Milliliter-Behälter, der auf dem Kühlelement platziert ist, mit der gekühlten Organoid-Seeding-Lösung und klicken Sie auf Start Run, um den Pipettierroboter in Aktion zu setzen. Anschließend wird die Mikrotiterplatte mit einer Geschwindigkeit von 100 g für eine Minute bei vier Grad Celsius zentrifugiert.
Um das Abgabeprotokoll für Medikamente mit der Steuerungssoftware für digitale Medikamentenspender zu erstellen, bewegen Sie den Mauszeiger über Platte 1 über dem Plattenlayout. Wählen Sie "Plattenattribute bearbeiten" und geben Sie den Plattentyp als 384-Well, das zusätzliche Volumen als 50 Mikroliter und den DMSO-Grenzwert als 1 % "Flüssigkeiten hinzufügen" ein, indem Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen" neben "Flüssigkeiten" klicken und auf die neu erstellte Flüssigkeit doppelklicken, um sie zu benennen. Wählen Sie dann die Klasse als DMSO-basiert oder wässrig plus Tween 20 aus und geben Sie die Konzentration ein.
Um das Plattenlayout für die Medikamententitration zu erstellen, wählen Sie Wells und klicken Sie auf Titration. Wählen Sie für Flüssigkeit das gewünschte Medikament aus, zusammen mit der gewünschten höchsten Konzentration und der niedrigsten Konzentration. Wählen Sie für Replikate mindestens zwei aus und wählen Sie das gewünschte Titrationsmuster aus.
Um das Plattenlayout für die Positivkontrolle zu erstellen, wählen Sie drei Vertiefungen aus, klicken Sie auf Wert einstellen und füllen Sie zwei mikromolare Staurosporin aus einem 10-Millimol-Bestand in DMSO ein, um den maximalen Zelltod zu induzieren. Wählen Sie für Cytotox Green alle verwendeten Vertiefungen aus, klicken Sie auf Wert einstellen und geben Sie einen Wert von 60 Nanomolar pro Vertiefung ein. Wählen Sie für die Negativkontrolle und die DMSO-Normalisierung alle Vertiefungen mit zusätzlichen vier Vertiefungen für die Fahrzeugsteuerung aus.
Klicken Sie nun mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Normalisierung, bevor Sie die normalisierte Fluidklasse als DMSO-basiert zuweisen. Normalisieren Sie dann auf das Volumen der höchsten Klasse, um eine gleiche DMSO-Konzentration in jeder Vertiefung zu erhalten. Klicken Sie anschließend auf den Pfeil unter Ausführen in der oberen linken Ecke und wählen Sie Immer simulieren, gefolgt von einem Klick auf Simulieren, um Fehler zu identifizieren und die Volumina jedes Medikaments zu erhalten, das zubereitet werden soll.
Deaktivieren Sie nun Always Simulate unter der Schaltfläche Ausführen, bevor Sie auf Ausführen klicken, um das Medikamentenabgabeprotokoll zu starten, und folgen Sie den Anweisungen. Bringen Sie die Dichtungsmembran auf die Mikrotiterplatte auf, um eine Verdunstung zu verhindern. Öffnen Sie die Live-Cell-Imager-Steuerungssoftware und wählen Sie Methoden-Editor Neu aus, bevor Sie zu Datei wechseln, um die XML-Beispielmethode zu importieren.
Alternativ können Sie den Anweisungen im Manuskript folgen, um eine neue Datei zu erstellen. Klicken Sie dann auf Start, um den Scanvorgang zu starten, T0.To die Daten zusammenzuführen und zu komprimieren, einen neuen übergeordneten Ordner für die Übertragung aller einzelnen Experimentordner zu erstellen, die für jeden Scan zu jedem Zeitpunkt von der Live-Cell-Imager-Steuerungssoftware generiert wurden, und benennen Sie die jeweiligen Ordner gemäß den Anweisungen im Manuskript. Bereiten Sie eine XLSX-Plattenkarte in der digitalen Medikamentenspendersteuerungssoftware vor, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Plattenkarten-Layout des Medikamentenabgabeprotokolls klicken und alle Vertiefungen kopieren, um die Daten in eine XLSX-Datei einzufügen.
Entfernen Sie die Daten von Cytotox Green und Staurosporin, fügen Sie eine Matrix für die Zelllinie hinzu und geben Sie eine Negativkontrolle und eine Positivkontrolle ein. Öffnen Sie das Datenkomprimierungstool. Klicken Sie auf Suchen, wählen Sie den übergeordneten Ordner aus und klicken Sie auf Komprimieren, um die Komprimierung der Bilddaten zu starten.
Alle TIFF-Bilddateien werden in einem neuen Datensatzordner innerhalb des Elternordners zu einem einzigen HDF5 für jedes Well komprimiert. Um die Bilder zu analysieren, gehen Sie zur Web-App-Plattform für die Bildanalyse, melden Sie sich an und klicken Sie auf der Registerkarte "Startseite" auf "Neues Projekt hinzufügen". Geben Sie den Projektnamen ein, klicken Sie auf Weiter, und wählen Sie Neues Experiment hinzufügen aus, bevor Sie den Datensatzordner hochladen, der die HDF5-Dateien enthält.
Gehen Sie nach dem Hochladen in den Projekt- und Experimentordner, um auf Plate Map hochladen zu klicken, um zusätzliche Funktionen zu erhalten. Klicken Sie dann nacheinander auf Analyse ausführen, wählen Sie Multi-Organoid-Analyse, Standardparameter und schließlich Analysieren, um die Bildanalyse zu starten. Klicken Sie auf Ergebnisse herunterladen, um die Rohdatentabellen herunterzuladen, die die Messungen für jedes Bohrloch und die segmentierten Bilder oder Videos enthalten, bevor die Genauigkeit der Analyse für die weitere Datenverarbeitung bestätigt wird.
Um die Variationen in der Dichte und Größe des Organoid-Seedings zu berücksichtigen, wurden wachstumsratenbasierte Metriken verwendet, um die Variationen zwischen den Replikaten zu reduzieren, wie die reduzierten Fehlerbalken zeigen. Die Bilder für die Negativkontrolle, die Positivkontrolle und die kombinierte Gemcitabin- und Paclitaxel-behandelte PDTO zeigten, dass die Therapie überwiegend einen Wachstumsstillstand mit einer begrenzten Menge an Zelltod induzierte, was einem normalisierten Arzneimittelansprechen (NDR) knapp unter Null entspricht. Bei der Verwendung von zwei zusätzlichen Linien, PDAC_052 und PDAC_087, wurde ein deutlicher Unterschied in der Wachstumsrate zwischen den drei Linien beobachtet, was die Verwendung von GR-Metriken unterstützt.
Die NDR-Dosis-Wirkungs-Kurven führten zu einem erhöhten Dynamikbereich und einer erhöhten Trennung zwischen den drei verschiedenen Patienten im Vergleich zu den GR-Kurven. Die Bestimmung des NDR über die Zeit zeigte, dass PDAC_052 und PDAC_060 eine sehr ähnliche Zytostatika-Reaktion auf eine niedrige Dosis von Gemcitabin-Paclitaxel aufwiesen, während eine deutliche differentielle zytostatische versus zytotoxische Reaktion für die entsprechenden mittleren und hohen Dosen beobachtet werden konnte. Diese Arzneimittelreaktionen stimmten mit den klinischen Reaktionen überein, die bei den Patienten beobachtet wurden.
Die klonale Dynamik zeigte, dass PDAC_087 nach der Behandlung die resistentesten Subklone aufwiesen, was mit der aggressiven Natur der Krankheit übereinstimmt, die bei dem Patienten beobachtet wurde, der interessanterweise auch am wenigsten empfindlich auf die Positivkontrolle Staurosporin reagierte. Der wichtigste Aspekt des Protokolls besteht darin, alle Lösungen, die ECM enthalten, während des Seedings gekühlt zu halten, da eine falsche Erstarrung der ECM die nachgeschaltete Bildanalyse beeinträchtigen kann. Die Automatisierung der Nasslaborarbeit, der Bildanalyse und der nachgelagerten Datenverarbeitung kann hilfreich sein, um die Forschung zu beschleunigen und neuartige Kombinationstherapien leichter zu identifizieren.
