يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة تكاملية تجمع بين فحوصات علم الأحياء الدقيقة الكلاسيكية والتصوير الحي أحادي الخلية لتوصيف الخلايا الثابتة للإشريكية القولونية بعد العلاج بارتفاع مستوى الأوفلوكساسين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تحليل ظاهرة الثبات على مستوى السكان والخلية الواحدة. يسمح الجمع بين تحليل السكان والخلية الواحدة بالتوصيف الجزيئي والخلوي للنمط الظاهري للاستمرار.
للبدء ، قم بخط السلالة البكتيرية المثيرة للاهتمام من مخزون الجلسرين المجمد على صفيحة أجار LB ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل لمدة 15 إلى 19 ساعة للحصول على مستعمرات واحدة. قم بتلقيح مستعمرة معزولة في أنبوب زجاجي يحتوي على خمسة ملليلتر من وسط نمو MOPS المكمل ب 0.4٪ جلوكوز ، وإذا لزم الأمر ، أضف مضادا حيويا انتقائيا إلى الوسط. ضع الأنبوب في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة طوال الليل.
في اليوم التالي ، أجهزة الطرد المركزي ملليلتر واحد من الثقافة في 2،300 غرام لمدة ثلاث دقائق لحبيبات الخلايا ، وإعادة تعليق الحبيبات برفق بنفس الحجم من PBS. قم بقياس OD عند 600 نانومتر ، واحسب الحجم المطلوب ل OD600 الأولي من 0.01 في الحجم النهائي من 2 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف ملليلتر من MOPS glycerol 0.4٪ في بئر ذات قاع شفاف ، صفيحة 24 بئرا ، وقم بتلقيحها بحجم الاستزراع المحسوب بين عشية وضحاها.
ضع اللوحة المكونة من 24 بئرا في قارئ صفيحة مجهرية آلي لمراقبة OD600 لمدة 24 ساعة. اضبط قارئ الصفيحة الدقيقة لقياس OD600 كل 15 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وبدوران مداري مرتفع يبلغ 140 دورة في الدقيقة. قم بإذابة 100 ملليلتر من أجار LB ، وقم بتخزين القارورة عند 55 درجة مئوية لتجنب التصلب.
قم بإعداد ست قوارير زجاجية صغيرة ، وماصة خمسة ملليلتر من وسط أجار LB السائل في كل قارورة باستخدام ماصة معقمة. خذ 10 ميكرولتر من خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من محلول مخزون أوفلوكساسين ، وخفف في 90 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. أضف كميات متزايدة من أوفلوكساسين المخفف إلى كل من القوارير الزجاجية الستة التي تحتوي على وسط أجار LB للحصول على تركيز نهائي من صفر إلى 0.1 ميكروغرام لكل ملليلتر من أوفلوكساسين.
امزج المحلول عن طريق تدوير القوارير عدة مرات ، واسكب وسائط أجار LB المضافة بالمضادات الحيوية في صفيحة استزراع من ستة آبار. دع الآجار يبرد حتى يصلب ، وجفف اللوحة قبل الاستخدام. تمييع ثقافة بكتيرية بين عشية وضحاها إلى كثافة الخلية النهائية من واحد في 10 إلى CFU السابع لكل ملليلتر مع برنامج تلفزيوني.
ضع ميكرولتر من المستنبتة المخففة على كل بئر من الطبق المجفف المكون من ستة آبار. اترك البقع تجف قبل وضع الطبق في حاضنة عند 37 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، تحقق من تركيز أوفلوكساسين الذي يمنع نمو مستعمرات البكتيريا.
صب ما يقرب من 25 ملليلتر من أجار LB المحضر في طبق بتري. ثم أضف خمس إلى ثماني حبات زجاجية معقمة لكل طبق صلب ومجفف. عكس وتسمية اللوحات.
بعد ذلك ، قم بإعداد أنابيب زجاجية مخففة تسلسلية عشرة أضعاف تحتوي على 900 ميكرولتر من محلول كبريتات المغنيسيوم 0.01 مولار. في أنبوب زجاجي ، قم بتخفيف ثقافة ليلية في وسط جديد ومعدل درجة الحرارة إلى OD600 نهائي يبلغ حوالي 0.001 ، واترك الثقافة تنمو بين عشية وضحاها في حاضنة. في اليوم التالي ، عندما يصل OD600 إلى 0.3 ، قم بنقل 100 ميكرولتر من الثقافة للتخفيف وفقا لبيانات الفحص الموضعي.
أداء تخفيف المسلسل عشرة أضعاف من الثقافة البكتيرية. ثم لوحة 100 ميكرولتر من الثقافة المخففة على لوحات أجار LB المعدة. أضف التركيز المطلوب من أوفلوكساسين إلى الثقافة البكتيرية ، واستمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية أثناء الهز.
في النقاط الزمنية ذات الصلة ، اسحب 100 ميكرولتر من الثقافة ، وقم بتخفيف الثقافة وفقا لبيانات الفحص الموضعي. لوحة 100 ميكرولتر من الثقافة المخففة على لوحات أجار LB. في اليوم التالي ، احسب مستعمرات الصفائح المحتضنة بين عشية وضحاها عند أعلى تخفيفين يمكن اكتشاف المستعمرات الخاصة بهما.
احسب نسبة البقاء على قيد الحياة عن طريق تطبيع CFU لكل مليلتر في كل نقطة زمنية عند CFU لكل مليلتر عند T0 ، وارسم القيمة الطبيعية لقاعدة اللوغاريتم 10 كدالة للوقت. قم بإزالة محلول الحفظ من كل بئر من صفيحة الموائع الدقيقة ، واستبدله بوسط استزراع جديد. قم بإغلاق لوحة الموائع الدقيقة بنظام المشعب بالنقر فوق الزر Seal أو من خلال برنامج الموائع الدقيقة.
بعد ذلك ، على واجهة برنامج الموائع الدقيقة ، قم بإجراء تسلسل فتيلة أول بالنقر فوق تشغيل تسلسل فتيلة السائل. احتضان اللوحة في خزانة يتم التحكم فيها حراريا من المجهر عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل قبل بدء التصوير المجهري. ثم ابدأ تسلسل تشغيل Liquid Priming الثاني قبل بدء التجربة.
قم بإغلاق لوحة الموائع الدقيقة بالنقر فوق Unseal Plate على واجهة برنامج الموائع الدقيقة. استبدل الوسط في الآبار ب 200 ميكرولتر من الوسط الطازج ، والمضادات الحيوية التي تحتوي على وسط طازج ، وعينة استزراع مخففة 0.01 OD في الوسط الطازج. بعد إغلاق لوحة الموائع الدقيقة كما هو موضح من قبل ، ضع اللوحة على هدف المجهر داخل خزانة المجهر.
في برنامج الموائع الدقيقة ، انقر فوق تشغيل تسلسل تحميل الخلية للسماح بتحميل الخلايا في لوحة الموائع الدقيقة. اضبط التركيز البؤري الأمثل باستخدام وضع الضوء المرسل ، وحدد عدة مناطق ذات أهمية حيث يمكن ملاحظة عدد خلايا مناسب يصل إلى 300 خلية لكل حقل. في برنامج الموائع الدقيقة ، قم بتحرير تشغيل تسلسل مخصص لبرمجة حقن الوسط الطازج عند 6.9 كيلو باسكال لمدة ست ساعات إلى البئرين الأول والثاني ، يليه الوسط الذي يحتوي على مضاد حيوي عند 6.9 كيلو باسكال أو ست ساعات إلى بئر ثلاثة ، وأخيرا الوسط الطازج عند 6.9 كيلو باسكال لمدة 24 ساعة إلى البئرين الرابع والخامس.
قم بإجراء التصوير المجهري في وضع الفاصل الزمني بإطار واحد كل 15 دقيقة باستخدام الضوء المرسل ومصدر ضوء الإثارة لمراسل الفلورسنت ، وابدأ برنامج الموائع الدقيقة. افتح برنامج ImageJ أو Fiji على الكمبيوتر، واسحب صور الفحص المجهري بفاصل زمني للمكدس الفائق إلى شريط تحميل فيجي. استخدم الصورة، متبوعة باللون، ثم Make Composite لدمج القنوات المختلفة للمكدس الفائق.
استخدم الصورة، اللون، ثم ترتيب القنوات إذا كانت القنوات لا تتوافق مع اللون المرغوب. افتح المكون الإضافي MicrobeJ ، واكتشف الخلايا البكتيرية باستخدام واجهة التحرير اليدوي. احذف الخلايا المكتشفة تلقائيا ، وحدد يدويا الخلايا الثابتة ذات الاهتمام إطارا تلو الآخر.
بعد الاكتشاف ، استخدم رمز النتيجة في واجهة التحرير اليدوي MicrobeJ لإنشاء جدول ResultJ. استخدم جدول ResultJ للحصول على رؤى حول المعلمات المختلفة ذات الأهمية لتحليل الخلية الواحدة، واحفظ ملف ResultJ. تم تحديد MIC من ofloxacin لكلا السلالتين ليكون 0.06 ميكروغرام لكل ملليلتر ، مما يشير إلى أن اندماج hupA-mCherry لم يؤثر على حساسية أوفلوكساسين مقارنة بالسلالة البرية المتجانسة المنشأ.
أظهر الفحص الموضعي استنساخا معزولا عند التخفيفات المناسبة بمرور الوقت ، على سبيل المثال ، 10 إلى التخفيف الخامس السالب في الوقت صفر. في مقايسة القتل الزمني ، لوحظ منحنى ثنائي الطور نموذجي حيث يعكس المنحدر الأول القتل السريع للسكان غير الثابتين. أظهرت المرحلة الثانية معدل قتل أبطأ ، وكشفت عن وجود خلايا ثابتة تتحمل الأدوية.
والجدير بالذكر أن منحنى قتل الوقت يظهر أن بروتين اندماج hupA-mCherry لم يؤثر على حركية قتل الوقت. في تجربة الموائع الدقيقة ، تشير مرحلة النمو الأولى إلى أن الخلايا كانت قابلة للحياة وتنقسم قبل علاج أوفلوكساسين. بعد مرحلة النمو الأولى هذه ، تم حظر انقسام الخلايا بمجرد وصول المضاد الحيوي إلى الخلايا.
بعد علاج أوفلوكساسين ، عند التروية بوسط جديد ، لم تتمكن الغالبية العظمى من الخلايا من استئناف النمو. في المقابل، يمكن لمجموعة فرعية صغيرة أن تستطيل وتولد خلايا خيطية، والتي تعرف بأنها الخلايا الثابتة. ولدت خيوط الانقسام المستمر خلايا ابنة متعددة ، بدأ معظمها في النمو والانقسام بشكل مشابه للخلايا غير المعالجة.
ارتبطت الزيادة في طول الخلية بزيادة في إجمالي كثافة مضان mCherry ، مما يعكس إعادة تشغيل النسخ المتماثل وزيادة وفرة النيوكليويدات. عند استخدام سلالة تحتوي على مراسل داخل الخلايا لدراسة الثبات ، فمن الإمبراطوري أن وجود المراسل لا يتداخل مع النمو ، MIC ، والقتل مقارنة بسلالة من النوع البري. يمكن تطبيق الإجراء الموصوف هنا على الحالات وأنواع البكتيريا الأخرى لمراقبة الاستجابات الخلوية للبيئات أو الضغوط المتغيرة.
باستخدام مراسلين فلورسنت آخرين في إعداد مماثل ، يمكن التحقيق في رؤى جديدة في فسيولوجيا الخلايا الثابتة.
