O protocolo aqui descrito fornece um método integrativo combinando ensaios clássicos de microbiologia com imagens vivas unicelulares para caracterizar células persistentes de Escherichia coli após tratamento com alto teor de ofloxacina. A principal vantagem dessa técnica é analisar o fenômeno de persistência em nível populacional e unicelular. A combinação de análise populacional e unicelular permite a caracterização molecular e celular do fenótipo de persistência.
Para começar, estique a cepa bacteriana de interesse de um estoque congelado de glicerol em uma placa de ágar LB e incube a 37 graus Celsius durante a noite por um período de 15 a 19 horas para obter colônias únicas. Inocular uma colônia isolada em um tubo de vidro contendo cinco mililitros de meio de crescimento MOPS suplementado com glicose a 0,4% e, se necessário, adicionar um antibiótico seletivo ao meio. Coloque o tubo em uma incubadora de agitação a 37 graus Celsius e 180 rpm durante a noite.
No dia seguinte, centrifugar um mililitro de cultura a 2.300 g por três minutos para pellet das células, e ressuspender suavemente o pellet com o mesmo volume de PBS. Meça o OD a 600 nanômetros e calcule o volume necessário para um OD600 inicial de 0,01 em um volume final de dois mililitros. Em seguida, adicione dois mililitros de glicerol MOPS 0,4% em um poço de uma placa de fundo transparente de 24 poços e inocular com o volume de cultura noturno calculado.
Coloque a placa de 24 poços em um leitor de microplacas automatizado para monitorar o OD600 por 24 horas. Configure o leitor de microplacas para medir o OD600 a cada 15 minutos a uma temperatura de 37 graus Celsius e com uma alta rotação orbital de 140 rpm. Derreta 100 mililitros de ágar LB e armazene o frasco a 55 graus Celsius para evitar a solidificação.
Preparar seis pequenos frascos de vidro e pipetar cinco mililitros de meio líquido de ágar LB em cada frasco usando uma pipeta estéril. Tome 10 microlitros da solução estoque de cinco miligramas por mililitro de ofloxacina e dilua em 90 microlitros de água ultrapura. Adicionar volumes crescentes de ofloxacina diluída a cada um dos seis frascos de vidro contendo meio ágar LB para obter uma concentração final de zero a 0,1 microgramas por mililitro de ofloxacina.
Misture a solução girando os frascos várias vezes e despeje o meio de ágar LB adicionado com antibiótico em uma placa de cultura de seis poços. Deixe o ágar esfriar até a solidificação e seque a placa antes de usar. Diluir uma cultura bacteriana durante a noite para uma densidade celular final de uma vez 10 a sétima UFC por mililitro com PBS.
Identifique dois microlitros de cultura diluída em cada poço da placa seca de seis poços. Deixe as manchas secarem antes de colocar a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, verifique em qual concentração de ofloxacina o crescimento de colônias de bactérias está inibido.
Despeje aproximadamente 25 mililitros do ágar LB preparado em uma placa de Petri. Em seguida, adicione cinco a oito contas de vidro estéreis a cada placa solidificada e seca. Inverta e rotule as placas.
Em seguida, prepare tubos de vidro de diluição seriada dez vezes contendo 900 microlitros de solução de sulfato de magnésio 0,01 molar. Em um tubo de vidro, diluir uma cultura durante a noite em meio fresco e ajustado à temperatura até um OD600 final de aproximadamente 0,001, e permitir que a cultura cresça durante a noite em uma incubadora. No dia seguinte, quando o OD600 atingir 0,3, transfira 100 microlitros da cultura para diluição de acordo com os dados do ensaio spot.
Realizar uma diluição seriada dez vezes maior da cultura bacteriana. Em seguida, placa de 100 microlitros da cultura diluída sobre as placas de ágar LB preparadas. Adicione a concentração desejada de ofloxacina na cultura bacteriana e continue a incubar a 37 graus Celsius enquanto agita.
Em momentos relevantes, retirar 100 microlitros da cultura e diluir a cultura de acordo com os dados do ensaio local. Placa de 100 microlitros da cultura diluída sobre placas de ágar LB. No dia seguinte, conte as colônias das placas incubadas durante a noite nas duas diluições mais altas para as quais as colônias podem ser detectadas.
Calcular a razão de sobrevivência normalizando a UFC por mililitro em cada ponto de tempo na UFC por mililitro em T0 e plotar o valor normalizado da base logarítmica 10 em função do tempo. Retire a solução de conservação de todos os poços da placa microfluídica e substitua-a por meio de cultura fresco. Sele a placa microfluídica com o sistema coletor clicando no botão Seal ou através do software microfluídico.
Em seguida, na interface do software microfluídico, execute uma primeira sequência de priming clicando em Run Liquid Priming Sequence. Incubar a placa em um gabinete do microscópio controlado por termostato a 37 graus Celsius por um mínimo de duas horas antes de iniciar a imagem da microscopia. Em seguida, inicie uma segunda sequência de escorvamento líquido antes de iniciar o experimento.
Feche a placa microfluídica clicando em Unseal Plate na interface do software microfluídico. Substitua o meio nos poços por 200 microlitros de meio fresco, contendo antibiótico e amostra de cultura diluída em 0,01 OD no meio fresco. Depois de selar a placa microfluídica, como demonstrado anteriormente, coloque a placa sobre a objetiva do microscópio dentro do gabinete do microscópio.
No software microfluídico, clique em Run Cell Loading Sequence para permitir o carregamento das células na placa microfluídica. Defina um foco ideal usando o modo de luz transmitida e selecione várias regiões de interesse onde um número de célula apropriado de até 300 células por campo pode ser observado. No software microfluídico, edite o Run a Custom Sequence para programar a injeção de meio fresco a 6,9 kilopascals por seis horas nos poços um e dois, seguido pelo meio contendo antibiótico a 6,9 kilopascals ou seis horas para o poço três e, finalmente, o meio fresco a 6,9 kilopascals por 24 horas nos poços quatro e cinco.
Execute imagens de microscopia no modo time-lapse com um quadro a cada 15 minutos usando a luz transmitida e a fonte de luz de excitação para o repórter fluorescente e inicie o programa microfluídico. Abra o software ImageJ ou Fiji no computador e arraste as imagens de microscopia de lapso de tempo de hiperpilha para a barra de carregamento de Fiji. Use Imagem, seguido de Cor e, em seguida, Criar Composto para fundir os diferentes canais da hiperpilha.
Use Imagem, Cor e Organizar Canais se os canais não corresponderem à cor desejada. Abra o plugin MicrobeJ e detecte as células bacterianas usando a interface de edição manual. Exclua as células detectadas automaticamente e contorne manualmente as células persistentes de interesse quadro a quadro.
Após a detecção, use o ícone Resultado na interface de edição manual do MicrobeJ para gerar uma tabela ResultJ. Use a tabela ResultJ para obter insights sobre diferentes parâmetros de interesse da análise de célula única e salve o arquivo ResultJ. A CIM de ofloxacina para ambas as cepas foi determinada em 0,06 microgramas por mililitro, indicando que a fusão hupA-mCherry não afetou a sensibilidade da ofloxacina em comparação com a cepa isogênica selvagem.
O ensaio spot mostrou clones isolados em diluições apropriadas ao longo do tempo, por exemplo, 10 à quinta diluição negativa no tempo zero. No ensaio tempo-morte, uma curva bifásica típica foi observada onde a primeira inclinação reflete a rápida matança da população não persistente. A segunda fase mostrou uma taxa de mortalidade mais lenta, revelando a presença de células persistentes tolerantes a drogas.
Notavelmente, a curva time-kill mostra que a proteína de fusão hupA-mCherry não afetou a cinética time-kill . No experimento microfluídico, a primeira fase de crescimento indica que as células estavam viáveis e se dividindo antes do tratamento com ofloxacina. Após essa primeira fase de crescimento, a divisão celular foi bloqueada assim que o antibiótico atingiu as células.
Após o tratamento com ofloxacina, na perfusão com meio fresco, a grande maioria das células não conseguiu retomar o crescimento. Em contraste, uma pequena subpopulação poderia alongar e gerar células filamentosas, que são definidas como as células persistentes. O filamento persistente em divisão gerou várias células filhas, a maioria das quais começou a crescer e se dividir de forma semelhante às células não tratadas.
O aumento no comprimento celular correlacionou-se com um aumento na intensidade total da fluorescência mCherry, o que reflete o reinício da replicação e um aumento na abundância nucleóide. Ao usar uma cepa contendo um repórter intracelular para estudar a persistência, é imperial que a presença do repórter não interfira no crescimento, na CIM e na matança em comparação com uma cepa selvagem. O procedimento aqui descrito pode ser aplicado a outras condições e espécies de bactérias para monitorar as respostas celulares a ambientes em mudança ou estresses.
Usando outros repórteres fluorescentes em uma configuração idêntica, novos insights sobre a fisiologia de células persistentes podem ser investigados.
