여기에 설명된 프로토콜은 높은 오플록사신 처리 후 대장균 지속성 세포를 특성화하기 위해 고전적인 미생물학 분석과 단일 세포 라이브 이미징을 결합한 통합 방법을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 집단 및 단일 세포 수준에서 지속성 현상을 분석하는 것입니다. 집단과 단일 세포 분석을 결합하면 지속성 표현형의 분자 및 세포 특성 분석이 가능합니다.
먼저, LB 한천 플레이트에 냉동 글리세롤 스톡에서 관심있는 박테리아 균주를 줄무늬로 만들고 섭씨 37도에서 밤새 15-19 시간 동안 배양하여 단일 콜로니를 얻습니다. 0.4% 포도당이 보충된 5밀리리터의 MOPS 성장 배지가 들어 있는 유리관에 분리된 콜로니를 접종하고 필요한 경우 선택적 항생제를 배지에 추가합니다. 튜브를 섭씨 37도 및 180rpm의 진탕 인큐베이터에 밤새 놓습니다.
다음날, 배양액 1 밀리리터를 2, 300 g에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 펠렛을 동량의 PBS로 부드럽게 재현탁시켰다. 600 나노 미터에서 OD를 측정하고 2 밀리리터의 최종 부피에서 0.01의 초기 OD600에 필요한 부피를 계산합니다. 다음으로, 2 밀리리터의 MOPS 글리세롤 0.4 % 배지를 투명한 바닥, 24 웰 플레이트의 웰에 넣고 계산 된 하룻밤 배양 부피를 접종합니다.
24웰 플레이트를 자동 마이크로플레이트 리더에 넣어 600시간 동안 OD24을 모니터링합니다. 섭씨 37도의 온도와 140rpm의 높은 궤도 회전으로 15분마다 OD600을 측정하도록 마이크로플레이트 리더를 설정합니다. LB 한천 100ml를 녹이고 플라스크를 섭씨 55도에서 비축하여 응고를 방지합니다.
6개의 작은 유리 플라스크를 준비하고, 멸균 피펫을 사용하여 5밀리리터의 액체 LB 한천 배지를 각 플라스크에 피펫팅한다. 밀리리터 당 5 밀리그램의 10 마이크로 리터의 플록사신 원액을 취하여 90 마이크로 리터의 초순수로 희석하십시오. LB 한천 배지를 함유하는 6개의 유리 플라스크 각각에 희석된 오플록사신의 증가하는 부피를 첨가하여 오플록사신의 밀리리터당 0 내지 0.1 마이크로그램의 최종 농도를 얻는다.
플라스크를 여러 번 회전시켜 용액을 혼합하고 항생제가 첨가된 LB 한천 배지를 6웰 배양 플레이트에 붓습니다. 한천이 응고될 때까지 식히고 사용하기 전에 플레이트를 건조시키십시오. 하룻밤 동안 박테리아 배양액을 PBS로 10 내지 7 CFU의 최종 세포 밀도로 희석한다.
2마이크로리터의 희석된 배양액을 건조된 6웰 플레이트의 모든 웰에 발견합니다. 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 밤새 넣기 전에 반점을 말리십시오. 다음날, 어떤 ofloxacin 농도에서 박테리아 콜로니의 성장이 억제되는지 확인하십시오.
준비된 LB 한천의 약 25 밀리리터를 페트리 접시에 붓습니다. 그런 다음 5-8 개의 멸균 유리 비드를 각 응고 및 건조 된 플레이트에 첨가하십시오. 접시를 뒤집고 라벨을 붙입니다.
다음으로, 900 마이크로 리터의 0.01 몰 황산 마그네슘 용액을 함유하는 10 배 연속 희석 유리관을 준비한다. 유리관에서, 신선하고 온도 조절된 배지에서 하룻밤 배양물을 약 0.001의 최종 OD600으로 희석하고, 배양물이 인큐베이터에서 밤새 성장하도록 한다. 다음날, OD600이 0.3에 도달하면, 스팟 분석 데이터에 따라 희석을 위해 배양물 100 마이크로리터를 옮긴다.
박테리아 배양의 10 배 연속 희석을 수행하십시오. 이어서, 희석된 배양액 100 마이크로리터를 준비된 LB 한천 플레이트 상에 플레이트한다. 박테리아 배양액에 원하는 농도의 오플록사신을 첨가하고 흔들면서 섭씨 37도에서 계속 배양합니다.
관련 시점에서 배양액 100마이크로리터를 회수하고 스팟 분석 데이터에 따라 배양액을 희석합니다. 희석된 배양물을 LB 한천 플레이트 상에 100 마이크로리터의 플레이트를 한다. 다음날, 콜로니를 검출할 수 있는 가장 높은 두 개의 희석액에서 하룻밤 배양된 플레이트의 콜로니를 계산합니다.
T0에서 밀리리터당 CFU에서 각 시점에서 밀리리터당 CFU를 정규화하여 생존율을 계산하고 로그 밑이 10인 정규화된 값을 시간 함수로 플로팅합니다. 미세유체 플레이트의 모든 웰에서 보존 용액을 제거하고 신선한 배양 배지로 교체합니다. Seal 버튼을 클릭하거나 미세유체 소프트웨어를 통해 매니폴드 시스템으로 미세유체 플레이트를 밀봉합니다.
다음으로, 미세유체 소프트웨어 인터페이스에서 Run Liquid Priming Sequence(액체 프라이밍 시퀀스 실행)를 클릭하여 첫 번째 프라이밍 시퀀스를 수행합니다. 현미경 이미징을 시작하기 전에 섭씨 37도의 온도 조절 현미경 캐비닛에서 최소 2시간 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 실험을 시작하기 전에 두 번째 Run Liquid Priming Sequence를 시작합니다.
microfluidic 소프트웨어 인터페이스에서 Unseal Plate(플레이트 개봉 해제)를 클릭하여 미세유체 플레이트를 밀봉합니다. 웰 내의 배지를 200 마이크로리터의 신선한 배지, 항생제 함유 신선한 배지, 및 0.01 OD 희석된 배양 샘플을 신선한 배지로 교체한다. 앞에서 설명한 대로 미세유체 플레이트를 밀봉한 후 플레이트를 현미경 캐비닛 내부의 현미경 대물렌즈에 놓습니다.
microfluidic 소프트웨어에서 Run Cell Loading Sequence(세포 로딩 시퀀스 실행)를 클릭하여 세포를 미세유체 플레이트에 로딩할 수 있습니다. 투과광 모드를 사용하여 최적의 초점을 설정하고 필드당 최대 300개의 셀을 관찰할 수 있는 여러 관심 영역을 선택합니다. 미세유체 소프트웨어에서 Run a Custom Sequence를 편집하여 6.9킬로파스칼의 신선한 배지를 웰 1과 2에 6시간 동안 주입한 다음, 항생제가 포함된 배지를 6.9킬로파스칼 또는 6시간 동안 웰 3에 주입하고, 마지막으로 6.9킬로파스칼의 신선한 배지를 웰 4와 5에 24시간 동안 주입합니다.
투과광과 형광 리포터용 여기 광원을 사용하여 15분마다 한 프레임씩 타임랩스 모드에서 현미경 이미징을 수행하고 미세유체 프로그램을 시작합니다. 컴퓨터에서 ImageJ 또는 Fiji 소프트웨어를 열고 하이퍼스택 타임랩스 현미경 이미지를 Fiji 로딩 바에 드래그합니다. Image, Color, Make Composite를 차례로 사용하여 하이퍼스택의 여러 채널을 융합합니다.
Image(이미지), Color(색상)를 사용한 다음 채널이 원하는 색상과 일치하지 않는 경우 Arrange Channels(채널 정렬)를 사용합니다. MicrobeJ 플러그인을 열고 수동 편집 인터페이스를 사용하여 박테리아 세포를 감지합니다. 자동으로 감지된 셀을 삭제하고 관심 있는 지속형 셀을 프레임별로 수동으로 간략하게 설명합니다.
감지 후 MicrobeJ 수동 편집 인터페이스의 결과 아이콘을 사용하여 ResultJ 테이블을 생성합니다. ResultJ 테이블을 사용하여 단일 세포 분석에서 관심 있는 다양한 파라미터에 대한 통찰력을 얻고 ResultJ 파일을 저장합니다. 두 균주에 대한 오플록사신의 MIC는 밀리리터당 0.06마이크로그램으로 결정되었으며, 이는 hupA-mCherry 융합이 동종 야생형 균주와 비교하여 오플록사신의 민감도에 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다.
스팟 분석은 시간 경과에 따른 적절한 희석, 예를 들어 시간 0에서 10 내지 음성 5번째 희석에서 단리된 클론을 보여주었다. 시간-사멸 분석에서, 첫 번째 기울기가 비지속적 개체군의 빠른 사멸을 반영하는 전형적인 이상성 곡선이 관찰되었습니다. 두 번째 단계에서는 더 느린 사멸 속도를 보여 약물 내성 지속 세포의 존재가 드러났습니다.
특히, 시간-사멸 곡선은 hupA-mCherry 융합 단백질이 시간-사멸 동역학에 영향을 미치지 않았음을 보여줍니다. 미세유체 실험에서, 제1 성장기는 세포가 오플록사신 처리 전에 생존 가능하고 분열되었음을 나타낸다. 이 첫 번째 성장 단계 후, 항생제가 세포에 도달하자마자 세포 분열이 차단되었습니다.
오플록사신 치료 후, 신선한 배지로 관류했을 때, 대다수의 세포는 성장을 재개할 수 없었다. 대조적으로, 작은 하위 집단은 길어지고 필라멘트 세포를 생성할 수 있으며, 이는 지속 세포로 정의됩니다. 분열하는 지속기 필라멘트는 여러 개의 딸 세포를 생성했으며, 대부분은 처리되지 않은 세포와 유사하게 성장하고 분열하기 시작했습니다.
세포 길이의 증가는 총 mCherry 형광 강도의 증가와 상관관계가 있으며, 이는 복제 재시작 및 핵체 풍부도의 증가를 반영합니다. 지속성을 연구하기 위해 세포 내 리포터를 포함하는 균주를 사용할 때, 리포터의 존재가 야생형 균주에 비해 성장, MIC 및 사멸을 방해하지 않는다는 것이 임페리얼입니다. 여기에 설명된 절차는 변화하는 환경 또는 스트레스에 대한 세포 반응을 모니터링하기 위해 다른 조건 및 박테리아 종에 적용될 수 있습니다.
동일한 설정에서 다른 형광 리포터를 사용하여 지속 세포의 생리학에 대한 새로운 통찰력을 조사할 수 있습니다.
