Il protocollo qui descritto fornisce un metodo integrativo che combina saggi di microbiologia classica con imaging live a singola cellula per caratterizzare le cellule persistenti di Escherichia coli dopo un trattamento ad alto contenuto di ofloxacina. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di analizzare il fenomeno di persistenza a livello di popolazione e singola cellula. La combinazione dell'analisi della popolazione e di una singola cellula consente la caratterizzazione molecolare e cellulare del fenotipo di persistenza.
Per iniziare, striare il ceppo batterico di interesse da uno stock di glicerolo congelato su una piastra di agar LB e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte per un periodo di 15-19 ore per ottenere singole colonie. Inoculare una colonia isolata in un tubo di vetro contenente cinque millilitri di terreno di crescita MOPS integrato con glucosio allo 0,4% e, se necessario, aggiungere un antibiotico selettivo nel mezzo. Posizionare il tubo in un'incubatrice scuotente a 37 gradi Celsius e 180 giri / min durante la notte.
Il giorno seguente, centrifugare un millilitro di coltura a 2.300 g per tre minuti per pellettare le cellule e risospendere delicatamente il pellet con lo stesso volume di PBS. Misurare l'OD a 600 nanometri e calcolare il volume necessario per un OD600 iniziale di 0,01 in un volume finale di due millilitri. Quindi, aggiungere due millilitri di glicerolo MOPS 0,4% medio in un pozzetto di una piastra trasparente a 24 pozzetti e inoculare con il volume di coltura notturno calcolato.
Inserire la piastra a 24 pozzetti in un lettore automatico di micropiastre per monitorare l'OD600 per 24 ore. Impostare il lettore di micropiastre per misurare l'OD600 ogni 15 minuti a una temperatura di 37 gradi Celsius e con un'elevata rotazione orbitale di 140 giri / min. Fondere 100 millilitri di agar LB e conservare il matraccio a 55 gradi Celsius per evitare la solidificazione.
Preparare sei piccoli matraccio di vetro e pipettare cinque millilitri di mezzo agar LB liquido in ciascun matraccio usando una pipetta sterile. Prendi 10 microlitri dei cinque milligrammi per millilitro di soluzione madre di loxacina e diluisci in 90 microlitri di acqua ultrapura. Aggiungere volumi crescenti di ofloxacina diluita a ciascuno dei sei matramenti di vetro contenenti mezzo agar LB per ottenere una concentrazione finale da zero a 0,1 microgrammi per millilitro di ofloxacina.
Mescolare la soluzione ruotando più volte i palloni e versare il mezzo di agar LB aggiunto con antibiotico in una piastra di coltura a sei pozzetti. Lasciare raffreddare l'agar fino alla solidificazione e asciugare la piastra prima dell'uso. Diluire una coltura batterica durante la notte a una densità cellulare finale di una volta 10 al settimo CFU per millilitro con PBS.
Individuare due microlitri di coltura diluita su ogni pozzetto della piastra essiccata a sei pozzetti. Lasciare asciugare le macchie prima di posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, controllare a quale concentrazione di ofloxacina è inibita la crescita delle colonie di batteri.
Versare circa 25 millilitri dell'agar LB preparato in una capsula di Petri. Quindi aggiungere da cinque a otto perle di vetro sterili a ciascuna piastra solidificata ed essiccata. Capovolgere ed etichettare i piatti.
Quindi, preparare tubi di vetro di diluizione seriale dieci volte contenenti 900 microlitri di soluzione di solfato di magnesio 0,01 molare. In un tubo di vetro, diluire una coltura durante la notte in mezzo fresco e regolato in temperatura fino a un OD600 finale di circa 0,001 e lasciare che la coltura cresca durante la notte in un incubatore. Il giorno seguente, quando l'OD600 raggiunge 0,3, trasferire 100 microlitri della coltura per la diluizione in base ai dati del saggio spot.
Eseguire una diluizione seriale di dieci volte della coltura batterica. Quindi placcare 100 microlitri della coltura diluita sulle piastre di agar LB preparate. Aggiungere la concentrazione desiderata di ofloxacina nella coltura batterica e continuare a incubare a 37 gradi Celsius mentre si agita.
Nei punti temporali rilevanti, prelevare 100 microlitri della coltura e diluire la coltura di conseguenza ai dati del saggio spot. Piastra 100 microlitri della coltura diluita sulle piastre di agar LB. Il giorno successivo, contare le colonie delle piastre incubate durante la notte alle due diluizioni più alte per le quali è possibile rilevare le colonie.
Calcolare il rapporto di sopravvivenza normalizzando il CFU per millilitro in ogni punto temporale al CFU per millilitro a T0 e tracciare il valore normalizzato della base logaritmica 10 in funzione del tempo. Rimuovere la soluzione di conservazione da ogni pozzetto della piastra microfluidica e sostituirla con terreno di coltura fresco. Sigillare la piastra microfluidica con il sistema del collettore cliccando sul pulsante Seal o tramite il software microfluidico.
Successivamente, sull'interfaccia del software microfluidico, eseguire una prima sequenza di priming facendo clic su Run Liquid Priming Sequence. Incubare la piastra in un armadio termostatico del microscopio a 37 gradi Celsius per un minimo di due ore prima di iniziare l'imaging microscopico. Quindi avviare una seconda sequenza di adescamento liquido prima di iniziare l'esperimento.
Sigillare la piastra microfluidica facendo clic su Unseal Plate sull'interfaccia del software microfluidico. Sostituire il terreno nei pozzetti con 200 microlitri di terreno fresco, antibiotico contenente terreno fresco e 0,01 OD campione di coltura diluito nel terreno fresco. Dopo aver sigillato la piastra microfluidica come dimostrato in precedenza, posizionare la piastra sull'obiettivo del microscopio all'interno dell'armadio del microscopio.
Nel software microfluidico, fare clic su Run Cell Loading Sequence per consentire il caricamento delle celle nella piastra microfluidica. Impostare una messa a fuoco ottimale utilizzando la modalità luce trasmessa e selezionare diverse regioni di interesse in cui è possibile osservare un numero di celle appropriato fino a 300 celle per campo. Sul software microfluidico, modificare la sequenza Run a Custom per programmare l'iniezione di terreno fresco a 6,9 kilopascal per sei ore ai pozzetti uno e due, seguita dal mezzo contenente antibiotico a 6,9 kilopascal o sei ore al pozzo tre, e infine il mezzo fresco a 6,9 kilopascal per 24 ore ai pozzetti quattro e cinque.
Eseguire l'imaging al microscopio in modalità time-lapse con un fotogramma ogni 15 minuti utilizzando la luce trasmessa e la sorgente luminosa di eccitazione per il reporter fluorescente e avviare il programma microfluidico. Aprire il software ImageJ o Fiji sul computer e trascinare le immagini di microscopia time-lapse hyperstack nella barra di caricamento Fiji. Utilizzare Immagine, seguito da Colore, quindi Crea composito per fondere i diversi canali dell'hyperstack.
Utilizzare Immagine, Colore e quindi Disponi canali se i canali non corrispondono al colore desiderato. Apri il plug-in MicrobeJ e rileva le cellule batteriche utilizzando l'interfaccia di modifica manuale. Eliminare le celle rilevate automaticamente e delineare manualmente le celle persistenti di interesse fotogramma per fotogramma.
Dopo il rilevamento, utilizzare l'icona Risultato nell'interfaccia di modifica manuale MicrobeJ per generare una tabella ResultJ. Utilizzare la tabella ResultJ per ottenere informazioni dettagliate sui diversi parametri di interesse dell'analisi a cella singola e salvare il file ResultJ. La MIC di ofloxacina per entrambi i ceppi è stata determinata essere 0,06 microgrammi per millilitro, indicando che la fusione hupA-mCherry non ha influenzato la sensibilità di ofloxacina rispetto al ceppo isogenico wild-type.
Il test spot ha mostrato cloni isolati a diluizioni appropriate nel tempo, ad esempio, da 10 alla quinta diluizione negativa al tempo zero. Nel saggio time-kill, è stata osservata una tipica curva bifasica in cui la prima pendenza riflette la rapida uccisione della popolazione non persistente. La seconda fase ha mostrato un tasso di uccisione più lento, rivelando la presenza di cellule persistenti tolleranti ai farmaci.
In particolare, la curva time-kill mostra che la proteina di fusione hupA-mCherry non ha influenzato la cinetica time-kill. Nell'esperimento microfluidico, la prima fase di crescita indica che le cellule erano vitali e si dividevano prima del trattamento con ofloxacina. Dopo questa prima fase di crescita, la divisione cellulare è stata bloccata non appena l'antibiotico ha raggiunto le cellule.
Dopo il trattamento con ofloxacina, in perfusione con terreno fresco, la stragrande maggioranza delle cellule non è stata in grado di riprendere la crescita. Al contrario, una piccola sottopopolazione potrebbe allungarsi e generare cellule filamentose, che sono definite come cellule persistenti. Il filamento persistente in divisione ha generato più cellule figlie, la maggior parte delle quali ha iniziato a crescere e dividersi in modo simile alle cellule non trattate.
L'aumento della lunghezza cellulare è correlato con un aumento dell'intensità totale della fluorescenza mCherry, che riflette il riavvio della replicazione e un aumento dell'abbondanza nucleoide. Quando si utilizza un ceppo contenente un reporter intracellulare per studiare la persistenza, è imperiale che la presenza del reporter non interferisca con la crescita, la microfonosi e l'uccisione rispetto a un ceppo wild-type. La procedura qui descritta può essere applicata ad altre condizioni e specie batteriche per monitorare le risposte cellulari a cambiamenti ambientali o stress.
Utilizzando altri reporter fluorescenti in una configurazione identica, è possibile sondare nuove conoscenze sulla fisiologia delle cellule persistenti.
