تلعب الحمض النووي الريبي الدائري أدوارا تنظيمية مهمة في العمليات البيولوجية المختلفة. هذا البروتوكول مناسب للمبتدئين لإجراء تحليل دائري للحمض النووي الريبي في مجال تفاعلات المضيف والممرض. هنا قمنا بتجميع عدد قليل من الأدوات لإنشاء بروتوكول مبسط مطلوب للتنبؤ الآمن بالحمض النووي الريبي وتحديده ، والتخصيب الوظيفي الآمن للحمض النووي الريبي ، والحمض النووي الريبي الآمن ، والتنبؤ بتفاعل الحمض النووي الريبي الصغير ، وإنشاءات شبكة CCE RNA.
يمكن تطبيق بروتوكول التبسيط هذا على العينات السريرية لتحديد بعض المرشحين والقيم التشخيصية والتنبؤية في بيئة تفاعل المضيف والممرض. أتوقع أن أولئك الذين ليس لديهم معرفة مسبقة بالبرمجة أن يكافحوا في المرحلة الأولى من هذه التقنية. لذلك ، أنصح بتعلم أساسيات لغات البرمجة المستخدمة في هذه التقنية.
أعتقد أن النظر عادة إلى كيفية تطبيق لغة البرمجة يكون أكثر إفادة وأسهل في الفهم مقارنة بالقراءة وحدها. للبدء ، افتح محطة Linux وفي دليل الجينوم المرجعي للمضيف ، قم بتنفيذ الأوامر bwa index و hisat2-build لفهرسة الجينوم. قم بإعداد ملف تكوين yml يحتوي على اسم الملف ومسار الأدوات والمسار إلى الملفات المرجعية التي تم تنزيلها والمسار إلى ملفات الفهرس.
حدد نوع مكتبة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي وقم بتنفيذ أداة Ciriquant باستخدام المعلمات الافتراضية أو اليدوية. قم بإعداد ملف نصي يحتوي على قائمة من البيانات التي تحتوي على معرفات بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي ، والمسار إلى ملفات GTF الناتجة بواسطة Ciriquant وتجميع بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي سواء كانت مجموعة تحكم أو مجموعة معالجة. على محطة Linux ، قم بتشغيل prep_Ciriquant باستخدام ملف نصي معد كمدخل.
سيؤدي هذا التشغيل إلى إنشاء قائمة بالملفات. قم بإعداد ملف نصي ثان يحتوي على قائمة بالبيانات التي تحتوي على معرفات تسلسل الحمض النووي الريبي والمسار إلى إخراج ربط السلسلة الخاص بكل منها. يجب أن يكون تخطيط الملف مشابها للملف النصي المعد مسبقا بدون تشغيل عمود التجميع.
تشغيل الإعدادية. py مع هذا الملف النصي كمدخل لإنشاء ملفات مصفوفة عدد الجينات. تنفيذ Ciri_DE_Replicate مع library_info.
CSV ، circRNA_BSJ. CSV و gene_count_matrix. ملفات CSV كمدخلات لإخراج circRNA_DE النهائي.
ملف TSV. لتصفية وتحديد عدد الحمضيات المعبر عنها تفاضليا ، أو DE ، circRNAs ، افتح circRNA_DE. tsv مع R أو أي برنامج جداول بيانات آخر.
قم بفك ضغط واستخراج محتويات ملف CircR بعد تنزيله من صفحة CircR GitHub باستخدام البرامج ذات الصلة ، مثل WinRar أو 7-Zip. في دليل جديد حيث سيتم إجراء التحليل. ثم قم بتثبيت تطبيقات البرامج الأساسية مثل SAMTools و miRanda و RNAhybrid و Pybedtools قبل إجراء تحليل circRNA miRNA.
فهرس ملف الجينوم المرجعي للكائن محل الاهتمام باستخدام الأمر SAMtools FAIDX وقم بإعداد ملف إدخال يتكون من إحداثيات DE circRNAs ذات الأهمية في ملف سرير محدد بعلامة جدولة. بعد ذلك ، قم بتنفيذ Circr. py باستخدام Python3.
وكما تحدد الوسيطات ملف إدخال circRNA ، فإن الجينوم الأسرع للكائن الحي محل الاهتمام ، وإصدار الجينوم للكائن المحدد ، وعدد الخيوط ، واسم ملف الإخراج في سطر الأوامر. بمجرد اكتمال تحليل Circr ، يقوم البرنامج بإخراج ملف تفاعل circRNA-miRNA بتنسيق CSV. قم بإعداد ملف محدد بعلامات جدولة يحتوي على circRNAs ذات الأهمية و miRNA المستهدف.
يتكون العمود الأول من اسم circRNA. يحدد العمود الثاني نوع الحمض النووي الريبي من العمود الأول. العمود الثالث هو miRNA الهدف.
ويحدد العمود الرابع نوع الحمض النووي الريبي من العمود الثالث. لإنشاء خريطة شبكة ceRNA ، افتح برنامج Cytoscape ، وانتقل إلى ملف ، واستيراد ، وشبكة من ملف ، وحدد الملف المعد وقم بتحميله. اضغط على زر النمط لتغيير النمط المرئي للشبكة.
ثم اضغط على السهم الموجود على الجانب الأيمن من لون التعبئة ، واختر نوع العمود ، والتعيين المنفصل لنوع التعيين وحدد اللون المطلوب لكل نوع من أنواع الحمض النووي الريبي. بعد ذلك انتقل إلى الشكل لتغيير شكل العقد واتبع الخطوات الموضحة سابقا. بالنسبة لأنطولوجيا الجينات وتحليل KEGG للجين الأبوي ل circRNAs ، تأكد من ملف التعريف العنقودي والتنظيم. Hs.eg.
تم تثبيت حزم ديسيبل في الاستوديو الخاص بنا. قم باستيراد معلومات DE circRNA إلى مساحة عمل استوديو R. إذا رغب المستخدم في تحويل أسماء الجينات الأبوية إلى تنسيقات أخرى مثل entrezid ، فاستخدم وظيفة مثل مقدم العطاء.
استخدم معرف الجين كمدخل وقم بتشغيل تحليل أنطولوجيا الجينات والإثراء باستخدام وظيفة enrichGO داخل ملف تعريف الكتلة أو الحزمة باستخدام المعلمات الافتراضية. أخيرا ، قم بتشغيل تحليل التخصيب KEGG باستخدام معرف الجين كمدخل ووظيفة enrichKEGG داخل حزمة ملف تعريف الكتلة. يظهر مخطط الفقاعة لتحليل إثراء الأنطولوجيا الجينية للجينات الأبوية DE circRNA في هذا الشكل.
نسبة الجينات على المحور x هي عدد الجينات في قائمة المدخلات المرتبطة بمصطلح أنطولوجيا جينية معين مقسوما على العدد الإجمالي للجينات في هذا المصطلح. يتم تمثيل حجم النقطة في الرسم بقيمة العد وهي عدد الجينات في قائمة المدخلات المرتبطة بمصطلح أنطولوجيا جينية معين. كلما زاد حجم النقاط ، زاد عدد جينات الإدخال المرتبطة بالمصطلح.
يتم ترميز النقاط في الرسم بالألوان بناء على القيمة الاحتمالية التي يتم حسابها من خلال مقارنة التردد المرصود لمصطلح التعليق التوضيحي بالتردد المتوقع بالصدفة. الإثراء ذو دلالة إحصائية ويتم رسمه على مخطط الفقاعة فقط إذا كانت القيمة الاحتمالية أقل من 0.01. هنا ، تشمل الإثراء الثلاثة الأولى للعمليات البيولوجية التكوين الحيوي المعقد للبروتين النووي الريبي ، والاستجابة للفيروس وتنظيم الاستجابة للتحفيز الحيوي.
بينما بالنسبة للوظائف الجزيئية ، يتم إثراء النشاط التحفيزي الذي يعمل على الحمض النووي الريبي وربط الحمض النووي الريبي أحادي الشريط إحصائيا. بالنسبة للمكونات الخلوية ، يتم إثراء مجمع retromer فقط إحصائيا. توضح هذه الصورة التمثيلية تحليل التخصيب KEGG للجينات الأبوية DE circRNA في مخطط فقاعة.
تم إثراء مصطلحين فقط من KEGG في هذه الحالة ، الأنفلونزا A ومسارات دورة الحياة الفيروسية. أحد أهم الأشياء عند محاولة هذا الإجراء هو التأكد من نوع السمة الصحيح لمجموعة بيانات RNA circ التي تستخدمها عند تشغيل الإصابة الأولى. يساعد خط أنابيب التنسيق الحيوي المقدم هنا في التنبؤ بالحمض النووي الريبي العلماني المحتمل والتعليقات التوضيحية الوظيفية.
ومع ذلك ، ستظل هناك حاجة إلى التحقق الجيد لتوفير أدلة قوية. سيسمح هذا البروتوكول للباحثين باكتشاف الحمض النووي الريبي الآمن وأدوارهم الوظيفية المحتملة في الرموز المختلفة والتفاعلات الممرضة ، والتي يمكنهم دراستها بشكل أكبر.
