هذا البروتوكول هو نتيجة لتقييم الجوانب الرئيسية لإعداد مكتبة circrna، مثل نوع مجموعة، RNase R العلاج، كميات المدخلات وتأثيرها على الكشف عن سر الجيش الملكي النيبالي. وهو يتيح الكشف الأمثل عن الـCIRCRNA ويوفر بيانات عن المعلمات القابلة للتعديل حسب احتياجات المستخدم. إن تحديد الدوائر في أنواع عينات مختلفة سيساعدنا على فهم توزيع تعبيراتها بشكل أفضل ويمهد الطريق لتحديد الدور الوظيفي لهذه الجزيئات.
يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي عينة RNA الإجمالي. من المهم الاحتفاظ بعينات الحمض النووي الريبي على الجليد قبل بدء البروتوكول. تقييم القيم RIN و DV200 على Bioanalyzer Agilent أو TapeStation قبل الإعدادية، واتبع الإجراءات المناسبة عند العمل مع RNA.
تبدأ عن طريق تمييع الجيش الملكي النيبالي مجموع إلى أربعة ميكروغرام في 39 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase و pipetting ه صعودا وهبوطا لخلط. في أنبوب منفصل، استخدم 1x RNase R Buffer لتمييع RNase R إلى تركيز عمل يبلغ وحدتين لكل ميكرولتر. Pipette 39 ميكرولترات من مجموع الحمض النووي الريبي وخمسة ميكرولترات من 10x RNase R رد فعل العازلة في أنبوب رد فعل 1.5 ميكرولتر، ومزيج.
إضافة ستة ميكرولترات من RNase المخفف R.Then ضبط ماصة لحجم التفاعل الكامل، وخلط الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10 مرات. ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، مع التأكد من أن حجم التفاعل الكامل مغمور في حمام الماء. ثم، ضع الأنبوب على الجليد، والمضي قدما على الفور مع تنظيف الجيش الملكي النيبالي والتركيز.
قبل البدء، وإعداد العازلة غسل RNA عن طريق خلط التركيز مع 48 ملليلتر من الإيثانول 100٪، ووضع أعمدة تنقية في أنابيب جمع. عندما تكون جاهزة، إضافة اثنين من وحدات التخزين من RNA ملزمة المخزن المؤقت إلى RNase R-المعالجة العينة، ومزيج جيد. إضافة 150 ميكرولترات من 100٪ الإيثانول إلى الخليط لما مجموعه 300 ميكرولترات، ونقل وحدة التخزين بأكملها إلى العمود، والطرد المركزي لمدة 30 ثانية.
إزالة تدفق من خلال، وإضافة 400 ميكرولترات من RNA الإعدادية العازلة مباشرة إلى العمود. جهاز طرد مركزي لمدة 30 ثانية، والتخلص من خلال تدفق. ثم، إضافة 700 ميكرولترات من مخزن غسيل الحمض النووي الريبي إلى العمود، والطرد المركزي لمدة 30 ثانية، وتجاهل تدفق من خلال.
إضافة 400 ميكرولترات أخرى من الغسيل العازلة، والطرد المركزي لمدة دقيقتين، ونقل العمود إلى أنبوب جديد RNase خالية من 1.5 ملليلتر. إضافة بعناية 11 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase مباشرة إلى العمود عن طريق عقد تلميح ماصة الحق فوق مرشح العمود. دع العينة تجلس لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة.
تأكد من تدفق من خلال في أنبوب 1.5 ملليلتر، وتجاهل العمود. يمكن تخزين عينة الحمض النووي الريبي المنقى في ناقص 80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لإعداد المكتبة. نقل 10 ميكرولترات من RNA مجموع تنقية إلى بئر نظيفة في لوحة PCR 96-well.
إضافة خمسة microliters من RRNA ملزمة العازلة تليها خمسة microliters من مزيج إزالة RRNA، ثم ماص بلطف صعودا وهبوطا لخلط الكواشف. ختم لوحة، واحتضانه لمدة خمس دقائق في 68 درجة مئوية على كتلة ثيرموسيسير مسبق البرمجة ومحمّاة مسبقا. بعد الحضانة، والسماح لوحة الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
إزالة الختم من لوحة، وإضافة 35 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة دوامة rRNA الخرز إزالة إلى العينة. ضبط ماصة إلى 45 ميكروليترس، وماصات صعودا وهبوطا 10 إلى 20 مرات لخلط دقيق. دع اللوحة تجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
نقل لوحة إلى موقف مغناطيسي، واحتضان هناك لمدة دقيقة واحدة أو حتى يتم مسح الحل. نقل فائقة إلى بئر جديدة على لوحة. ثم نقل لوحة من موقف المغناطيسي إلى لوحة حامل.
دوامة RNA تنظيف الخرز حتى يتم تفريقها بشكل جيد، وإضافة 99 ميكرولترات من الخرز إلى العينة. الماصات صعودا وهبوطا لخلط، واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. نقل لوحة إلى موقف المغناطيسي، وتركها هناك لمدة خمس دقائق أو حتى الحل مسح، ثم إزالة وتجاهل جميع supernatant من البئر.
مع لوحة لا تزال على موقف المغناطيسي، إضافة 200 ميكرولترات من الطازجة أعد 80٪ الإيثانول إلى البئر دون تعطيل الخرز. اترك الإيثانول في البئر لمدة 30 ثانية، ثم قم بإزالته والتخلص منه. إضافة 11 ميكروليتر من عازلة Elution إلى البئر، وماصة لأعلى ونضزال لخلط.
احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين، ثم نقله مرة أخرى إلى موقف المغناطيسي، والاحتفاظ بها هناك حتى يتم مسح الحل. نقل 8.5 ميكرولترات من السوبر إلى بئر جديدة على نفس اللوحة، وإضافة 8.5 ميكرولترات من إلوت، التمهيدي، جزء عالية ميكس إلى كل بئر تحتوي على عينة. الماصات صعودا وهبوطا 10 مرات لخلط جيدا، وختم لوحة، واحتضانه لمدة ثماني دقائق في الحرارية محمّاة مسبقا إلى 94 درجة مئوية.
تبريد العينة إلى أربع درجات مئوية، وإزالة لوحة من الدراجات الحرارية، والطرد المركزي لفترة وجيزة. وتم تقييم طقمتين لإعداد المكتبات، هما تروسك وكابا، لهذا البروتوكول. وعموما، تم الكشف عن عدد أكبر من RNAs التعميم وانخفاض نسبة من الحمض النووي الريبي الريبوسي عند استخدام مجموعة TruSeq، لذلك تم اختيار TruSeq لإجراء مزيد من التجارب.
تم تقييم أهمية المعالجة المسبقة RNase R بمقارنة البيانات المتولدة من المكتبات المعالجة المسبقة وغير المعالجة مسبقة. وكما هو متوقع، تم تحديد عدد أكبر من الرنا قدامى التعميم في المكتبات المعالجة المسبقة مقارنة بالمكتبات غير المعالجة. تم تحسين كمية الإدخال RNA للكشف عن تنوع أعلى من الحمض النووي الريبي الدائري.
تم إعداد المكتبات باستخدام واحد واثنين وأربع ميكروغرام من المدخلات RNA، ولوحظ أعلى تنوع من أنواع الحمض النووي الريبي الدائري عند استخدام أربعة ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي. وقد استخدم البروتوكول الأمثل لمقارنة وفرة الجيش الملكي النيبالي الدائري في خمس مناطق في الدماغ من أربعة متبرعين أصحاء والأنواع الأخرى من الأنسجة من ستة متبرعين أصحاء. عموما، لوحظ وجود وفرة أعلى من RNase دائرية في الدماغ مقارنة مع أنواع الأنسجة الأخرى.
من المهم أن نتذكر أن تتبع الإجراءات المناسبة عند العمل مع الجيش الملكي النيبالي، بما في ذلك ارتداء القفازات، وتنظيف جيدا مقاعد البدلاء والماصات مع مناديل RNase أو رذاذ قبل البدء في البروتوكول، والحفاظ على RNA على الجليد مسبقا. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء التحقق من صحة متعامد مثل تسلسل Sanger من تقاطعات محيطة عرنيا محددة. اكتشاف الدوائر الجديدة والمزيد من الأدلة على وجودها يقتطع مجالا جديدا من البحوث لاستكشاف وظائفها البيولوجية.
