لقد قمنا بتطوير بروتوكول محدد ، قابل للاستنساخ ، وطويل الأمد لتسلسل الحمض النووي الريبي الصغير ولتحلي القراءات الطبيعية باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية مفتوحة المصدر. المزايا الرئيسية لاستراتيجيتنا هي أنه يجمع بدقة microRNAs من خلال تنقية هلام وأنه يمكن تطبيق تحليل المعلوماتية الحيوية بغض النظر عن كيفية جمع microRNAs. يمكن أن يكشف تسلسل الإنتاجية العالية من microRNAs عن نظرة ثاقبة في آليات المرض ، ومعالجة microRNAs ، وتحديد كمي دقيق للنهج العلاج الجيني التي تقدم RNAs الصغيرة.
تأكد من العمل في بيئة حرة RNase وإبقاء جميع المنتجات RNA على الجليد طوال العملية. إن تصور خطوات القطع الهلامية سيساعد المشاهدين على تحديد الحجم الصحيح للمنتجات المطلوبة لتطبيقات المصب. لثلاثة ربط محول رئيس, الجمع بين 11 ميكرولترات من الجيش الملكي النيبالي مع 1.5 ميكرولترات من ATP الحرة 10X T4RNA تفاعل عازلة, ميكرولتر واحد من البولي ايثيلين جلايكول, و 0.5 ميكرولترات من ثلاثة رابط رئيس.
سخني العينات على درجة حرارة 95 درجة مئوية على دراجة حرارة لمدة 30 إلى 40 ثانية، يليها التبريد على الجليد لمدة دقيقة واحدة. إضافة ميكرولتر واحد من T4RNA ligase اثنين واحتضان رد فعل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. في حين أن العينات هي احتضان، صب 15٪ polyacyrilamide هلام بين 0.8 ملليمتر لوحات زجاجية منفصلة في يلقي البلاستيك وإدراج مشط.
عندما يكون هلام قد توطدت، إضافة 0.5 5X TBE إلى الخزان والماصات بقوة لغسل آبار اليوريا المتبقية. بعد تشغيل ما قبل هلام البولي أكريلاميد لمدة 25 دقيقة في 375 فولت، تحميل العينات ترك على الأقل حارة واحدة في بين كل عينة. تحميل 20 ميكرولترات من مجموعتين على الأقل من علامات في نمط غير متناظرة لتتبع اتجاه هلام وتشغيل الجل في ثابت 375 فولت.
بعد 15 دقيقة، وزيادة إلى ثابت 425 فولت لبقية المدى وتشغيل هلام لمدة ساعتين تقريبا. في نهاية الشوط، استخدم فاصل لوحة لإزالة الجل من لوحات الزجاج ووضع الجل على حامي صفحة بلاستيكية. تمييع خمسة ميكرولترات من بروميد الإثيديوم في 500 ميكرولترات من الماء المقطر وإضافة الصبغة إلى الممرات علامة فوق أعلى علامة زرقاء خفيفة.
بعد ذلك ، استخدم شفرة حلاقة نظيفة لقطع المواد الهلامية من أعلى إلى علامة أدنى في كل حارة تحت الأشعة فوق البنفسجية ونقل القطع إلى أربعة في أربعة سنتيمترات مربعة من مختبر ختم الفيلم. قطع هلام مع حوالي ثلاث قطع أفقيا واثنين من التخفيضات عموديا لإنتاج 12 مربعات صغيرة. إضافة 400 ميكرولترات من 0.3 كلوريد الصوديوم المولر على فيلم الختم وتوجيه القطع هلام في أنابيب سيليكون 1.5 ملليلتر.
تهيج العينات على nutator في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، نقل 400 ميكرولترات من كل اابر إلى أنابيب جديدة. إضافة ملليلتر واحد من 100٪ الإيثانول وميكر واحد من 15 ملليغرام لكل ملليلتر الجليكوجين شارك في الانتقطار لكل أنبوب.
ثم تخزين الأنابيب في ناقص 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. لخمسة ربط رابط رئيس الوزراء، تدور أولا أسفل العينات المذابة وإعادة تعليق الكريات في الماء. بعد ذلك، إضافة 0.5 ميكرولترات من 100 ميكرومولار خمسة رابط رئيس الوزراء، وميكر واحد من T4RNA العازلة الليطالية، وميكر واحد من ATP 10 ملليمولار، وميكر واحد من البولي ايثيلين غليكول لكل عينة.
سخني التفاعلات عند 90 درجة مئوية لمدة 30 ثانية قبل وضعها على الجليد. ثم إضافة ميكرولتر واحد من T4RNA ligase واحد لكل أنبوب واحتضان ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. للنسخ العكسي، وجمع العينات عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه الهواء المجفف في 8.25 ميكرولترات من المياه الحرة النوى.
إضافة 0.5 ميكرولتررس من 100 ميكرومولار عكس النص الأساسي و5 microliters من 2X عكس مزيج رد فعل transcriptase من مجموعة تخليق الحمض النووي التكميلية. بعد ثلاث دقائق في 42 درجة مئوية، إضافة 1.5 ميكرولترات من 10X عكس الإنزيم نسخة إلى كل عينة لاحتضان 30 دقيقة في 42 درجة مئوية في ثيرموساير. بعد تحييد, إعداد تفاعل PCR مع 29.5 ميكرولترتر من الماء، وخمسة ميكرولترات من 10X طقطق العازلة، وميكر واحد من ثلاثي الفوسفات النيوكليوسيد، واثنين من microliters من 25 التمهيدي إلى الأمام، واثنين من microliters من 25 التمهيدي العكسي micromolar، 0.5 microlits من البوليميراز التقي، و 10 ميكرولترات من الحمض النووي المكامل عكس.
ثم تشغيل اثنين من ردود الفعل PCR. لتنقية جل agarose، إعداد جل agarose 4٪ مع أغاروز منخفض الذوبان وتحميل 40 ميكرولترات أو أكثر من المنتج PCR على هلام مع صبغة التحميل و 100 زوج قاعدة و 25 علامات حجم زوج قاعدة. بعد تشغيل هلام، وقطع الفرقة فوق 125 قاعدة زوج الفرقة واستخدام مجموعة استخراج هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
هزة لإذابة شريط هلام في المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة قبل استخدام المعدات المناسبة لتحديد مكتبة التسلسل النهائي. ثم استخدم أدوات المعلوماتية الحيوية المفتوحة المصدر المناسبة لتحليل بيانات التسلسل. في هذا التفاعل PCR تمثيلي على هلام agarose منخفضة تذوب، يمكن ملاحظة الحصول على المنتج المستنسخة الصحيحة بالمقارنة مع المنتج رابط رابط التي تم الحصول عليها والعينات غير المشبعة مقابل المشبعة.
بعد المحاذاة إلى دبابيس الشعر ميكرورنا الإنسان، يمكن ملاحظة توافق قوي بين ميكرورنا قراءة التهم في كل تكرار. تم اكتشاف ما مجموعه 306 نوع من أنواع ميكرورنا مع أكبر عدد من الخرائط لقراءة ميكرورنا 122. من المهم أن نتذكر أن قطع المواد الهلامية في الحجم المناسب لتمكين الانتعاش دقيقة من microRNAs.
بعد تسلسل microRNAs ، يمكن للمستخدمين تطبيق تحليل المعلوماتية الحيوية لتوصيف توزيع microRNAs داخل أنسجتهم ذات الاهتمام. وقد استخدمت هذه التقنية لتحديد كيفية معالجة الميكروبات والمغذيات والمغذيات الدقيقة التي يتم تغييرها في بعض أنواع السرطان. تأكد من ممارسة العناية عند التعامل مع بروميد الإثيديوم وعند النظر إلى المواد الهلامية تحت الضوء فوق البنفسجي.
