يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول كيفية فحص مثبطات إسكات الحمض النووي الريبي التي تفرزها مسببات الأمراض النباتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو توفير فحص سريع ودقيق وواسع النطاق لرنا إسكات تحديد القامع. تحضير خلطات التربة بوتينغ تتكون من 50٪ طحلب الخث، 30٪ البيرلايت، و 20٪ فيرميكوليت والأتوكلاف في 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
نقع يمزج التربة autoclaved مع محلول الأسمدة النباتية في غرام واحد للتر الواحد وccpackage لهم في الأواني الصغيرة المخزنة في صينية أكبر. زرع واحد أو اثنين من بذور نيكوتيانا bethamiana 16c على سطح التربة من كل وعاء. غطي الصينية بقبة بلاستيكية واسمح للبذور بانباتها.
ضع الصينية تحت غرف النمو الخفيفة ودرجات الحرارة التي تسيطر عليها مع درجة حرارة 23 إلى 25 درجة مئوية، 50 إلى 60٪ الرطوبة النسبية، وphotoperiod يوم طويل. بعد ثلاثة إلى أربعة أيام، تنبت البذور. اتخاذ القبة البلاستيكية قبالة والسماح للشتلات لتنمو في ظل نفس الظروف المستخدمة في خطوة الإنبات.
كل يومين إلى ثلاثة أيام، إضافة كمية مناسبة من الماء حفظ التربة رطبة ولكن لا نقع. كل 10 أيام، إضافة الأسمدة لتعزيز مزيد من النمو. الحفاظ على النباتات Nicotiana bethamiana 16c في ظل الظروف العادية حتى النباتات لديها ما لا يقل عن خمسة أوراق حقيقية متطورة بالكامل مع عدم وجود الإبط مرئية أو براعم الزهور والأوراق لها مظهر أخضر صحي.
استخدام 10 إلى 14 يوما نيكوتيانا bethamiana 16c النباتات لRNA النظامية إسكات المقايسات وثلاثة إلى أربعة أسابيع من أوراق نيكوتيانا bethamiana 16c لإسكات الحمض النووي الريبي المحلية المقايسة. استخدام طرف لاختيار مستعمرة إيجابية من لوحة LB وتطعيم الخلايا في أنبوب زجاجي يحتوي على خمسة ملليلتر من LB المتوسطة تكملها 50 ميكروغرام لكل ملليلتر Kanamycin و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر ريفامبيسين. تنمو الخلايا في 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 إلى 48 ساعة.
نقل 100 ميكرولترات من الثقافة إلى خمسة ملليلتر من LB المتوسطة تكملها مع نفس المضادات الحيوية، 10 ملليمولار MES في درجة الH 5.6، و 20 ميكرومولار AS. تنمو البكتيريا في 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 16 إلى 20 ساعة. الطرد المركزي الخلايا في 4،000 مرات ز لمدة 10 دقائق. تجاهل السوبر و resuspend بيليه في مليلترين من 10 ميليمولار المغنيسيوم كلوريد العازلة.
كرر الغسيل لضمان الإزالة الكاملة للمضادات الحيوية. تحديد كثافة ثقافة البكتيريا الزراعية من خلال قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر. ضبط ثقافة الخلية مع 10 ميليمولار المغنيسيوم كلوريد العازلة إلى OD 600 من 1.5 إلى 2.0.
إضافة 10 ملليمولار MES في درجة ح 5.6 و 150 micromolar AS إلى ثقافة التعليق النهائي واحتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات على الأقل دون اهتزاز. مزيج وحدات التخزين متساوية من ثقافة البكتيريا الزراعية التي تحتوي على 35S البروتين الفلورسنت الأخضر مع ثقافة البكتيريا الزراعية التي تحتوي على 35S الخيار فسيفساء فيروس القامع 2b، والمفتكة المفترضة أو ناقلات فارغة. باستخدام حقنة واحدة ملليلتر بدون إبرة، تتسلل بعناية وببطء إلى التعليقات الزراعية المختلطة على الجوانب الأباكسية من أوراق Nicotiana bethamiana 16c.
إزالة تعليق البكتيرية المتبقية من الأوراق مع مناديل الأنسجة الرخوة ودائرة هوامش البقع تسلل مع قلم علامة. ثلاثة إلى أربعة أيام بعد التسلل، واستخدام مصباح الموجات فوق البنفسجية طويلة للكشف بصريا الفلوري GFP في بقع تسلل الأوراق. أسبوعين بعد التسلل، واستخدام مصباح للكشف عن أوراق نمت حديثا من المصنع كله لإسكات الحمض النووي الريبي النظامية.
لعزل الجيش الملكي النيبالي الكلي من الأنسجة ورقة في أربعة إلى سبعة أيام بعد التسلل، وجمع أنسجة ورقة من تسلل Nicotiana bethamiana بقع 16c في هاون. ضع النيتروجين السائل في الهاون وطحن الأنسجة في مسحوق ناعم مع قضيب طحن ونقل المسحوق إلى أنبوب معقمة مليلتر. على الفور إضافة كاشف العزلة RNA في حجم ملليلتر واحد لكل 100 ملليغرام من الأنسجة إلى أنبوب عينة في غطاء محرك السيارة، دوامة بقوة لتجانس، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
إضافة الكلوروفورم في حجم 200 ميكرولتر لكل ملليلتر واحد من كاشف العزلة RNA إلى كل أنبوب في غطاء محرك السيارة، ويهز بقوة لمدة 15 ثانية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أجهزة الطرد المركزي المتجانسة في 12،000 مرات ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. نقل فائقة إلى أنبوب جديد RNase خالية والتخلص من بيليه.
إضافة 0.7 حجم من الايزوبروبانول إلى فائقة، عكس بلطف عدة مرات، واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. عجل بيليه RNA عن طريق الطرد المركزي في 12، 000 مرات ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. تجاهل المُندفع.
غسل بيليه مع 70٪ الإيثانول والهواء الجاف بيليه في غطاء محرك السيارة. حل الجيش الملكي النيبالي في الماء المعالج diethyl pyrocarbonate عن طريق احتضان في حمام الماء 65 درجة مئوية لمدة 10 إلى 20 دقيقة. لأداء تحليل البقعة الشمالية من مستويات RNA رسول GFP، وإعداد 1.2٪ الفورمالديهايد denaturing هلام agarose في 1X MOPS تشغيل العازلة.
اخلط الحمض النووي الريبي واحد إلى واحد مع صبغة تحميل الحمض النووي الريبي وتحريف الحمض النووي الريبي عن طريق الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. على الفور البرد العينات المشوهة على الجليد لمدة دقيقة واحدة. مع ماصة، تحميل العينات في آبار الجل والكهرباء في 100 فولت لمدة 50 دقيقة حتى يتم فصل جيدا RNA.
شطف هلام في 20X محلول ملحي سيترات الصوديوم العازلة لإزالة الفورمالديهايد. تنفيذ عملية نقل الشعيرات الدموية بين عشية وضحاها عن طريق إعداد 20X محلول صوديوم ملحي سيترات، طبقة واحدة من منشفة ورقية، طبقتين من ورق Whatman الرطب، طبقة واحدة من الجل، طبقة واحدة من غشاء النايلون، طبقتين من ورق Whatman الرطب، طبقتين من ورق Whatman الجاف، لوحة زجاجية واحدة، ووزن. في الصباح، يتم نقل الحمض النووي الريبي في الجل إلى غشاء النايلون.
نقع الغشاء في 2X ملحي الصوديوم سيترات وإصلاح الجيش الملكي النيبالي للغشاء عن طريق تعريض الغشاء الرطب للأشعة فوق البنفسجية crosslinking. المضي قدما وفقا للمخطوطة. وقد تم اختراق الأوراق المطورة بالكامل من ثلاثة إلى أربعة أسابيع نيكوتيانا bethamiana 16c النباتات المشتركة في بقع مع خليط البكتيريا الزراعية تحمل 35S GFP.
وفي غضون أربعة أيام بعد التسلل، تم تصوير الفلوريس من المنطقة المخترقة من GFP تحت الضوء الطبيعي والضوء طويل الموجات فوق البنفسجية. كشفت البقعة الشمالية أن GFP رسول الجيش الملكي النيبالي تراكمت أعلى في الأوراق التعبير عن 35S GFP بالإضافة إلى 35S CMV2b أو 35S GFP بالإضافة إلى 35S PSR1 مما كانت عليه في الأوراق التي تعبر عن 35S GFP بالإضافة إلى EV. تم إجراء فحص Agroinfiltration لتقييم انتشار إشارة إسكات في أوراق نيكوتيانا بيثاميانا 16c شتلات عمرها أسبوعان. في 14 يوما بعد التسلل، أكثر من 98٪ من EV لم تظهر إشارة واضحة GFP في الأوراق النظامية.
في حين أن كلا CMV2b و PSR1 منعت بكفاءة انتشار النظامية لإشارة إسكات. لوحظت الفلورية GFP في حوالي 80٪ من النباتات المشتركة تسللت وفي 20٪ المتبقية من النباتات المتسللة مع وجود سوى عدد قليل من الأوردة الحمراء ظهرت في الأوراق ظهرت حديثا. هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين لتحديد رواية RNA إسكات القامع يفرزها العديد من مسببات الأمراض النباتية.
مزيج من النباتات و OD السليم هو أهم شيء أن نتذكر عند محاولة هذا الإجراء. بعد هذا الإجراء، يمكن القيام التوصيف الوظيفي من RNA إسكات القامع لاستكشاف آلية كيفية هذه القامعين اضغط على إسكات RNA المضيف وما هو الإخراج. يرجى ارتداء نظارات السلامة عند التسلل النباتات وأيضا ارتداء قفازات اللاتكس خلال جميع خطوات التجربة.
