Наш протокол объединил несколько методов, которые доказали свою эффективность для долгосрочного поддержания органоидов. Это полезно для изучения старения при возрастных заболеваниях, где клинические проявления находятся вне периода развития. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она не требует какого-либо специализированного оборудования или реагентов.
Он в значительной степени основан на материалах, обычно встречающихся в лаборатории. Старение и нейродегенеративные заболевания стали предметом особого интереса, поскольку наши современные методы моделирования в основном сосредоточены на установленных фенотипах заболеваний, а не на ранних стадиях развития. Эмбриональные стволовые клетки и ИПСК являются очень деликатными клетками.
Начинающие пользователи должны быть осторожными и терпеливыми. Поскольку это долгосрочные посевы, следует набраться терпения с самого начала Для начала распылите 70% этанола на шовную нить и подготовьте микрофиламенты PLGA, перетирая шовную нить тупым концом скальпеля. Поместите волокно под микроскоп.
И с помощью линейки начинаем нарезать волокно на фрагменты длиной от 500 микрометров до одного миллиметра. Отрежьте в общей сложности около 25 миллиметров волокна и добавьте нити в 15-миллилитровую пробирку, содержащую один миллилитр раствора антибиотика-антимикотика. Затем в вытяжке разбавьте волокнистый раствор 10 миллилитрами DMEM/F-12 и встряхните, чтобы хорошо перемешать.
Затем добавьте 20 микролитров волокнистого раствора в три лунки 96-луночной пластины. Используя светлопольный микроскоп, подсчитайте и усредните волокна на лунку. Разбавьте или сконцентрируйте лунки раствором волокна в среднем от 5 до 10 микронитей на лунку.
После того, как ранее культивируемые индуцированные плюрипотентные стволовые клетки достигнут слияния от 70 до 80%, проверьте клетки под микроскопом при 10- или 20-кратном увеличении. Убедитесь, что колонии демонстрируют менее 10% площади спонтанной дифференцировки. Аспирируйте среду пипеткой и один раз промойте клетки DPBS.
Затем добавьте 500 микролитров раствора для отслоения клеток или 0,5 миллимоляра ЭДТА для диссоциации колоний и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение трех-пяти минут. Затем добавьте по одному миллилитру свежего носителя E8 в каждую лунку и аккуратно пипеткой, чтобы отделить все ячейки. Перенесите всю клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и добавьте еще один миллилитр свежего носителя E8.
Затем раскрутите ячейки при 290 г в течение трех минут при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости ресуспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре среды E6 с добавлением 50-микромолярного ингибитора ROCK и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Приготовьте клеточную суспензию желаемой плотности посадки в среде Е6 с добавлением ингибитора ROCK.
Затем добавьте 150 микролитров суспензии ячеек в каждую лунку 96-луночной пластины со сверхнизким креплением. Затем центрифугируйте пластину при 290 г в течение трех минут при комнатной температуре, чтобы принудительно агрегировать ячейки. Затем инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненной атмосфере с 5% углекислого газа для формирования эмбриоидного тела.
После 24 часов инкубации перенесите пластину в колпак и осторожно аспирируйте 120 микролитров среды с помощью пипетки, стараясь не аспирировать эмбриоидное тело, опуская кончик пипетки слишком далеко в лунку. Затем добавьте 150 микролитров свежей среды E6 с добавлением двух микромолярных XAV939 и ингибиторов SMAD в каждую лунку. Перенесите планшет обратно в инкубатор и ежедневно заменяйте среду свежеприготовленным E6 с добавлением ингибиторов.
На седьмой день инкубации проверьте, достигли ли все эмбриоидные тела диаметра от 550 до 600 микрометров и имеют ли гладкие, четкие края. На этом этапе они готовы к встраиванию во внеклеточный матрикс. Чтобы встроить органоиды, подготовьте вкладыши с ямочками, поместив четырехдюймовый лист термопластичной потолочной пленки на пустую коробку P200.
Затем используйте коническую трубку объемом 15 миллилитров или микроцентрифугу объемом 500 микролитров и осторожно вдавите лист пленки в отверстия, чтобы сделать 12 или желаемое количество углублений. Затем распылите 70% этанол на пленочный лист и дайте ему высохнуть внутри капюшона с включенным ультрафиолетовым светом не менее 30 минут. Тем временем разморозьте достаточное количество матрицы базальной мембраны на льду.
Затем, используя наконечник P200 с широким отверстием, перенесите одно эмбриоидное тело из 96-луночной пластины в каждую ямочку. Удалите как можно больше среды с помощью обычного наконечника пипетки, но не позволяйте эмбриозному телу высохнуть. Затем с помощью обычного предварительно охлажденного наконечника P200 добавьте примерно 30 микролитров неразбавленной мембранной матрицы к каждому органоиду, убедившись, что тело эмбриона находится как можно ближе к центру капли.
После того, как все эмбриоидные тела будут внедрены в матрицу, поместите пленочный лист в стерильную чашку Петри. Затем инкубируйте чашку Петри при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут в увлажненной атмосфере с 5% углекислого газа, чтобы мембранная матрица затвердела. Для дифференциации органоидов добавляют пять миллилитров подготовленных сред для дифференцировки с B-27 без витамина А в одну лунку 6-луночной пластины со сверхнизкой насадкой.
Разогрейте тарелку до 37 градусов Цельсия в инкубаторе. После того, как мембранная матрица затвердеет, перенесите встроенные эмбриоидные тела на 6-луночную пластину, вытолкнув углубления с обратной стороны листа пленки. При необходимости используйте один миллилитр среды из лунки и нанесите его на лист, чтобы отделить капли от листа пленки.
Встроенные эмбриоидные тела в мембранный матрикс дифференцировались в сторону церебральных органоидов, демонстрирующих отчетливые почковающиеся образования днем in vitro 10. На 30-й день in vitro органоиды созревают с использованием углубления или сэндвича. Многолетняя культура показывает церебральные органоиды, выращенные до значительных размеров.
На седьмой день in vitro эмбриоидные тела демонстрируют SOX2-положительные нейронные розетки, рассеянные незрелые нейроны и нейронные клетки-предшественники. В то время как днем in vitro 120 они демонстрируют зрелые нейронные маркеры, такие как MAP2 и NeuN. Эти цитоскелетные маркеры можно использовать в сочетании с другими постмитотическими маркерами, такими как даблкортин и синапсин, для зондирования синаптической пластичности и других возрастных снижений, а также дополнительных тканей мозга, таких как астроциты и глия.
Обеспечение того, чтобы края ткани оставались нетронутыми, имеет решающее значение. Чтобы свести к минимуму вредное усилие сдвига, прокладку трубопроводов следует выполнять медленно, например, при смене среды и встраивании органоидов. Замедленный рост органоидов позволяет изучать прогрессирование болезни в ранних клеточных проявлениях.
Создание органоидов прокладывает путь к раннему выявлению при лечении многих заболеваний.
