Nuestro protocolo combinó varias técnicas que han demostrado ser efectivas para el mantenimiento de organoides a largo plazo. Esto es útil para estudiar el envejecimiento en enfermedades relacionadas con la edad donde las manifestaciones clínicas están fuera del período de desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere ningún equipo especializado o reactivos.
Se basa en gran medida en materiales que se encuentran comúnmente en el laboratorio. El envejecimiento y las enfermedades neurodegenerativas se han convertido en un punto de interés particular, ya que nuestros métodos de modelado actuales se centran principalmente en fenotipos de enfermedades establecidas en lugar de las fases tempranas del desarrollo. Las células madre embrionarias y las iPSC son células muy delicadas.
Los usuarios primerizos deben ser amables y tener paciencia. Dado que estos son cultivos a largo plazo, uno debe ser paciente desde el principio Para comenzar, rocíe etanol al 70% sobre una hebra de sutura y prepare microfilamentos PLGA deshilachando la hebra de sutura con el extremo romo del bisturí. Coloque la fibra bajo un microscopio.
Y usando una regla, comience a cortar la fibra en fragmentos de hebras de 500 micrómetros a un milímetro de largo. Cortar unos 25 milímetros de la fibra en total y añadir los filamentos en un tubo de 15 mililitros que contenga un mililitro de solución antibiótico-antimicótica. A continuación, en la campana, diluya la solución de fibra con 10 mililitros de DMEM / F-12 y vórtice para mezclar bien.
Luego, agregue 20 microlitros de la solución de fibra a tres pocillos de una placa de 96 pocillos. Usando un microscopio de campo brillante, cuente y promedie las fibras por pozo. Diluya o concentre los pozos con la solución de fibra para promediar de 5 a 10 microfilamentos por pozo.
Una vez que las células madre pluripotentes inducidas previamente cultivadas hayan alcanzado una confluencia del 70 al 80%, verifique las células bajo un microscopio con un aumento de 10 o 20x. Asegúrese de que las colonias muestren menos del 10% de área de diferenciación espontánea. Aspirar el medio con una pipeta y lavar las células una vez con DPBS.
Luego, agregue 500 microlitros de solución de desprendimiento celular o 0.5 milimolar EDTA para disociar las colonias e incube a 37 grados centígrados durante tres a cinco minutos. A continuación, agregue un mililitro de medio E8 fresco a cada pocillo y pipete suavemente para separar todas las células. Transfiera toda la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y agregue otro mililitro de medio E8 fresco.
Luego, gire las células a 290 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en un mililitro del medio E6 suplementado con 50 inhibidores micromolares de ROCK y cuente las células con un hemocitómetro. Prepare una suspensión celular de la densidad de asiento deseada en medios E6 complementados con el inhibidor ROCK.
Luego, agregue 150 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de fijación ultra baja de 96 pocillos. A continuación, centrifugar la placa a 290 g durante tres minutos a temperatura ambiente para forzar el agregado de las células. Luego, incubar la placa a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono para la formación del cuerpo embrioide.
Después de 24 horas de incubación, transfiera la placa a la campana y aspire cuidadosamente 120 microlitros del medio con una pipeta, teniendo cuidado de no aspirar el cuerpo embrioide bajando la punta de la pipeta demasiado adentro del pozo. A continuación, agregue 150 microlitros de medios frescos E6 suplementados con dos micromolares XAV939 y los inhibidores de SMAD a cada pocillo. Transfiera la placa de nuevo a la incubadora y reemplace el medio diariamente con E6 recién preparado complementado con los inhibidores.
En el séptimo día de incubación, verifique si todos los cuerpos embrioides han alcanzado un diámetro de 550 a 600 micrómetros y muestran un borde liso y claro. En esta etapa, están listos para ser incrustados en una matriz extracelular. Para incrustar los organoides, prepare láminas de incrustación con hoyuelos colocando una lámina de película de techo termoplástica de cuatro pulgadas de largo en una caja P200 vacía.
Luego, use un tubo cónico de 15 mililitros o un tubo de microcentrífuga de 500 microlitros y presione suavemente la lámina de película en los orificios para hacer 12 o el número deseado de hoyuelos. A continuación, rocíe etanol al 70% en la lámina de película y déjela secar dentro de la campana con la luz UV encendida durante al menos 30 minutos. Mientras tanto, descongele una cantidad suficiente de matriz de membrana basal en hielo.
Luego, usando una punta P200 de ancho ancho, transfiera un cuerpo embrioide de la placa de 96 pocillos a cada hoyuelo. Retire la mayor cantidad de medios posible con una punta de pipeta normal, pero no deje que el cuerpo embrioide se seque. A continuación, con una punta P200 preenfriada regular, agregue aproximadamente 30 microlitros de matriz de membrana sin diluir a cada organoide, asegurándose de que el cuerpo del embrión esté lo más cerca posible del centro de la gota.
Una vez que todos los cuerpos embrioides estén incrustados en la matriz, coloque la hoja de película en una placa de Petri estéril. Luego, incube la placa de Petri a 37 grados centígrados durante 10 minutos en una atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono para permitir que la matriz de membrana se solidifique. Para la diferenciación organoide, agregue cinco mililitros del medio de diferenciación preparado con B-27 sin vitamina A a un pocillo de una placa de 6 pocillos de fijación ultrabaja.
Precaliente el plato a 37 grados centígrados en una incubadora. Una vez que la matriz de membrana se haya solidificado, transfiera los cuerpos embrioides incrustados a la placa de 6 pocillos empujando los hoyuelos desde la parte posterior de la hoja de película. Si es necesario, use un mililitro de medio del pozo y colóquelo sobre la hoja para separar las gotas de la lámina de película.
Los cuerpos embrioides incrustados en la matriz de membrana se diferenciaron hacia organoides cerebrales que mostraban distintas formaciones de gemación por día in vitro 10. En el día in vitro 30, los organoides maduran aún más utilizando hoyuelos o incrustaciones en sándwich. El cultivo a largo plazo muestra organoides cerebrales cultivados a tamaños significativos.
En el día siete in vitro, los cuerpos embrioides muestran rosetas neurales SOX2 positivas, neuronas inmaduras dispersas y células progenitoras neurales. Mientras que por día in vitro 120, exhiben marcadores neuronales maduros como MAP2 y NeuN. Estos marcadores citoesqueléticos se pueden usar junto con otros marcadores postmitóticos como la doble cortina y la sinapsina para detectar la plasticidad sináptica y otras disminuciones relacionadas con la edad, así como tejido cerebral adicional como astrocitos y glía.
Asegurar que los bordes del tejido permanezcan intactos es crítico. Para minimizar la fuerza de cizallamiento dañina, la tubería debe hacerse lentamente, por ejemplo, mientras se cambian los medios y la incrustación de organoides. El crecimiento lento de los organoides nos permite estudiar el progreso de la enfermedad en las manifestaciones celulares tempranas.
La creación de organoides allana el camino de la detección temprana en el tratamiento de muchas enfermedades.
