Il nostro protocollo ha combinato diverse tecniche che si sono dimostrate efficaci per il mantenimento a lungo termine degli organoidi. Questo è utile per studiare l'invecchiamento nelle malattie legate all'età in cui le manifestazioni cliniche sono al di fuori del periodo di sviluppo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede alcuna attrezzatura o reagenti specializzati.
È fortemente basato su materiali che si trovano comunemente in laboratorio. L'invecchiamento e le malattie neurodegenerative sono diventati un particolare punto di interesse poiché i nostri attuali metodi di modellazione si concentrano principalmente sui fenotipi di malattia stabiliti piuttosto che sulle prime fasi di sviluppo. Le cellule staminali embrionali e le iPSC sono cellule molto delicate.
Gli utenti alle prime armi dovrebbero essere gentili e avere pazienza. Poiché si tratta di colture a lungo termine, si dovrebbe essere pazienti fin dall'inizio Per iniziare, spruzzare il 70% di etanolo su un filo di sutura e preparare i microfilamenti PLGA sfilacciando il filo di sutura con l'estremità smussata del bisturi. Posizionare la fibra al microscopio.
E usando un righello, inizia a tagliare la fibra in frammenti di fili lunghi da 500 micrometri a un millimetro. Tagliare circa 25 millimetri della fibra in totale e aggiungere i filamenti in un tubo da 15 millilitri contenente un millilitro di soluzione antibiotico-antimicotica. Successivamente nel cappuccio, diluire la soluzione di fibre con 10 millilitri di DMEM / F-12 e vortice per mescolare bene.
Quindi, aggiungere 20 microlitri della soluzione di fibra a tre pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Utilizzando un microscopio a campo chiaro, contare e calcolare la media delle fibre per pozzetto. Diluire o concentrare i pozzetti con la soluzione di fibre in media da 5 a 10 microfilamenti per pozzetto.
Una volta che le cellule staminali pluripotenti indotte precedentemente coltivate hanno raggiunto il 70-80% di confluenza, controllare le cellule al microscopio con un ingrandimento di 10 o 20x. Assicurarsi che le colonie mostrino meno del 10% di area di differenziazione spontanea. Aspirare il mezzo con una pipetta e lavare le celle una volta con DPBS.
Quindi, aggiungere 500 microlitri di soluzione di distacco cellulare o 0,5 millimolari EDTA per dissociare le colonie e incubare a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Quindi, aggiungere un millilitro di materiale E8 fresco a ciascun pozzetto e pipettare delicatamente per staccare tutte le celle. Trasferire l'intera sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e aggiungere un altro millilitro di mezzo E8 fresco.
Quindi, girare le cellule a 290 g per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di mezzo E6 integrato con inibitore ROCK 50 micromolari e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Preparare una sospensione cellulare della densità di seduta desiderata in mezzi E6 integrati con l'inibitore ROCK.
Quindi, aggiungere 150 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa a 96 pozzetti. Quindi, centrifugare la piastra a 290 g per tre minuti a temperatura ambiente per forzare l'aggregazione delle cellule. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con il 5% di anidride carbonica per la formazione del corpo embrioide.
Dopo 24 ore di incubazione, trasferire la piastra sul cappuccio e aspirare con cura 120 microlitri del mezzo utilizzando una pipetta, facendo attenzione a non aspirare il corpo embrioide abbassando troppo la punta della pipetta nel pozzetto. Quindi, aggiungere 150 microlitri di mezzi E6 freschi integrati con due micromolari XAV939 e gli inibitori SMAD a ciascun pozzetto. Trasferire nuovamente la piastra nell'incubatore e sostituire quotidianamente il terreno con E6 appena preparato integrato con gli inibitori.
Al settimo giorno di incubazione, controllare se tutti i corpi embrioidi hanno raggiunto un diametro da 550 a 600 micrometri e mostrano un bordo liscio e chiaro. In questa fase, sono pronti per essere incorporati in una matrice extracellulare. Per incorporare gli organoidi, preparare fogli di incorporamento con fossette posizionando un foglio di pellicola termoplastica per soffitti lungo quattro pollici su una scatola P200 vuota.
Quindi, utilizzare un tubo conico da 15 millilitri o un tubo di microcentrifuga da 500 microlitri e premere delicatamente il foglio di pellicola nei fori per ottenere 12 o il numero desiderato di fossette. Quindi, spruzzare etanolo al 70% sul foglio di pellicola e lasciarlo asciugare all'interno del cappuccio con la luce UV accesa per almeno 30 minuti. Nel frattempo, scongelare una quantità sufficiente di matrice di membrana basale sul ghiaccio.
Quindi, utilizzando una punta P200 ad ampio foro, trasferire un corpo embrioide dalla piastra a 96 pozzetti a ciascuna fossetta. Rimuovere quanto più fluido possibile con una normale punta di pipetta, ma non lasciare asciugare il corpo embrioide. Successivamente, con una normale punta P200 pre-raffreddata, aggiungere circa 30 microlitri di matrice di membrana non diluita a ciascun organoide, assicurandosi che il corpo dell'embrione sia il più vicino possibile al centro della goccia.
Una volta che tutti i corpi embrioidi sono incorporati nella matrice, posizionare il foglio di pellicola in una capsula di Petri sterile. Quindi, incubare la capsula di Petri a 37 gradi Celsius per 10 minuti in un'atmosfera umidificata con anidride carbonica al 5% per consentire alla matrice della membrana di solidificarsi. Per la differenziazione organoide, aggiungere cinque millilitri del mezzo di differenziazione preparato con B-27 senza vitamina A a un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti di attacco ultra-bassa.
Preriscaldare la piastra a 37 gradi Celsius in un'incubatrice. Una volta che la matrice della membrana si è solidificata, trasferire i corpi embrioidi incorporati nella piastra a 6 pozzetti spingendo fuori le fossette dal retro del foglio di pellicola. Se necessario, utilizzare un millilitro di supporto dal pozzetto e convogliarlo sul foglio per staccare le goccioline dal foglio di pellicola.
I corpi embrioidi incorporati nella matrice di membrana si sono differenziati verso organoidi cerebrali che mostrano formazioni gemmose distinte di giorno in vitro 10. Al giorno in vitro 30, gli organoidi vengono ulteriormente maturati utilizzando fossette o incorporazione a sandwich. La cultura a lungo termine mostra organoidi cerebrali cresciuti a dimensioni significative.
Al settimo giorno in vitro, i corpi embrioidi mostrano rosette neurali SOX2 positive, neuroni immaturi sparsi e cellule progenitrici neurali. Mentre di giorno in vitro 120, mostrano marcatori neuronali maturi come MAP2 e NeuN. Questi marcatori citoscheletrici possono essere utilizzati in combinazione con altri marcatori postmitotici come la doppia cortina e la sinapsina per sondare la plasticità sinaptica e altri declini legati all'età, nonché tessuto cerebrale aggiuntivo come astrociti e glia.
Garantire che i bordi del tessuto rimangano intatti è fondamentale. Per ridurre al minimo la forza di taglio dannosa, le tubazioni dovrebbero essere eseguite lentamente, ad esempio, durante la sostituzione del supporto e l'incorporamento degli organoidi. La crescita organoide rallentata ci permette di studiare il progresso della malattia nelle prime manifestazioni cellulari.
La creazione di organoidi apre la strada alla diagnosi precoce nel trattamento di molte malattie.
