Nosso protocolo combinou várias técnicas que se mostraram eficazes para a manutenção de organoides a longo prazo. Isso é útil para estudar o envelhecimento em doenças relacionadas à idade em que as manifestações clínicas estão fora do período de desenvolvimento. A principal vantagem desta técnica é que não requer nenhum equipamento especializado ou reagentes.
É fortemente baseado em materiais comumente encontrados no laboratório. O envelhecimento e as doenças neurodegenerativas tornaram-se um ponto de interesse particular, uma vez que nossos métodos de modelagem atuais se concentram principalmente em fenótipos de doenças estabelecidas, em vez das fases iniciais do desenvolvimento. As células-tronco embrionárias e as iPSCs são células muito delicadas.
Usuários de primeira viagem devem ser gentis e ter paciência. Como são culturas de longa duração, deve-se ter paciência desde o início Para começar, borrife etanol a 70% em um fio de sutura e prepare microfilamentos de PLGA desfiando o fio de sutura com a extremidade romba do bisturi. Coloque a fibra sob um microscópio.
E usando uma régua, comece a cortar a fibra em fragmentos de fios de 500 micrômetros a um milímetro de comprimento. Corte cerca de 25 milímetros da fibra no total e adicione os filamentos em um tubo de 15 mililitros contendo um mililitro de solução antibiótico-antimicótica. Em seguida, no capô, dilua a solução de fibra com 10 mililitros de DMEM/F-12 e vórtice para misturar bem.
Em seguida, adicione 20 microlitros da solução de fibra a três poços de uma placa de 96 poços. Usando um microscópio de campo claro, conte e faça a média das fibras por poço. Diluir ou concentrar os poços com a solução de fibra até uma média de 5 a 10 microfilamentos por poço.
Uma vez que as células-tronco pluripotentes induzidas previamente cultivadas tenham atingido 70 a 80% de confluência, verifique as células ao microscópio em aumento de 10 ou 20x. Certifique-se de que as colônias apresentem menos de 10% de área de diferenciação espontânea. Aspirar o meio com uma pipeta e lavar as células uma vez com DPBS.
Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de descolamento celular ou EDTA 0,5 milimolar para dissociar as colônias e incube a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Em seguida, adicione um mililitro de mídia E8 fresca a cada poço e pipete suavemente para separar todas as células. Transfira toda a suspensão da célula para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicione mais um mililitro de meio E8 fresco.
Em seguida, gire as células a 290 g por três minutos à temperatura ambiente. Após o descarte do sobrenadante, ressuspender o pellet celular em um mililitro do meio E6 suplementado com 50 inibidor de ROCK micromolar e contar as células com hemocitômetro. Preparar uma suspensão celular da densidade de assentos desejada em meio E6 suplementado com o inibidor ROCK.
Em seguida, adicione 150 microlitros da suspensão celular em cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa de 96 poços. Em seguida, centrifugar a placa a 290 g por três minutos à temperatura ambiente para forçar a agregação das células. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono para a formação do corpo embrionário.
Após 24 horas de incubação, transfira a placa para a coifa e aspirar cuidadosamente 120 microlitros do meio usando uma pipeta, tomando cuidado para não aspirar o corpo embrióide baixando a ponta da pipeta muito para dentro do poço. Em seguida, adicione 150 microlitros de meio E6 fresco suplementado com dois micromolares XAV939 e os inibidores SMAD a cada poço. Transfira a placa de volta para a incubadora e substitua o meio diariamente por E6 recém-preparado suplementado com os inibidores.
No sétimo dia de incubação, verifique se todos os corpos embrionários atingiram um diâmetro de 550 a 600 micrômetros e exibem uma borda lisa e clara. Nesta fase, eles estão prontos para serem incorporados em uma matriz extracelular. Para incorporar os organoides, prepare folhas de incorporação onduladas colocando uma folha de filme de teto termoplástico de quatro polegadas em uma caixa P200 vazia.
Em seguida, use um tubo cônico de 15 mililitros ou um tubo de microcentrífuga de 500 microlitros e pressione suavemente a folha de filme nos orifícios para fazer 12 ou o número desejado de covinhas. Em seguida, borrife etanol 70% sobre a folha de filme e deixe secar dentro da coifa com a luz UV acesa por pelo menos 30 minutos. Enquanto isso, descongele uma quantidade suficiente de matriz de membrana basal no gelo.
Em seguida, usando uma ponta P200 de furo largo, transfira um corpo embrióide da placa de 96 poços para cada fossa. Retire o máximo de meio possível com uma ponta de pipeta normal, mas não deixe o corpo embrionário secar. Em seguida, com uma ponta P200 pré-resfriada regular, adicione aproximadamente 30 microlitros de matriz de membrana não diluída a cada organoide, garantindo que o corpo do embrião esteja o mais próximo possível do centro da gota.
Uma vez que todos os corpos embrionários estejam embutidos na matriz, coloque a folha de filme em uma placa de Petri estéril. Em seguida, incubar a placa de Petri a 37 graus Celsius por 10 minutos em uma atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono para permitir que a matriz da membrana se solidifique. Para a diferenciação organoide, adicione cinco mililitros do meio de diferenciação preparado com B-27 sem vitamina A a um poço de uma placa de 6 poços de fixação ultrabaixa.
Pré-aqueça a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora. Uma vez que a matriz de membrana tenha se solidificado, transfira os corpos embrionários embutidos para a placa de 6 poços, empurrando as covinhas da parte de trás da folha de filme. Se necessário, use um mililitro de mídia do poço e coloque-o na folha para desprender as gotículas da folha de filme.
Os corpos embrionários embutidos na matriz de membrana diferenciaram-se de organoides cerebrais exibindo formações brotantes distintas de dia in vitro 10. No dia in vitro 30, os organoides são amadurecidos usando a incorporação de covinha ou sanduíche. A cultura a longo prazo mostra organoides cerebrais crescidos a tamanhos significativos.
No sétimo dia, os corpos embrionários exibem rosetas neurais positivas para SOX2, neurônios imaturos dispersos e células progenitoras neurais. Enquanto que de dia in vitro 120, eles exibem marcadores neuronais maduros como MAP2 e NeuN. Esses marcadores citoesqueléticos podem ser usados em conjunto com outros marcadores pós-mitóticos, como doublecortin e synapsin para sondar a plasticidade sináptica e outros declínios relacionados à idade, bem como tecido cerebral adicional como astrócitos e glia.
Garantir que as bordas do tecido permaneçam intactas é fundamental. Para minimizar a força de cisalhamento prejudicial, a tubulação deve ser feita lentamente, por exemplo, durante a troca de meios e incorporação de organoides. O crescimento organoide retardado nos permite estudar a evolução da doença nas manifestações celulares precoces.
A criação de organoides abre caminho para a detecção precoce no tratamento de muitas doenças.
