Protokolümüz, uzun süreli organoid bakımı için etkili olduğu kanıtlanmış çeşitli teknikleri birleştirdi. Bu, klinik belirtilerin gelişim döneminin dışında olduğu yaşa bağlı hastalıklarda yaşlanmayı incelemek için yararlıdır. Bu tekniğin temel avantajı, herhangi bir özel ekipman veya reaktif gerektirmemesidir.
Ağırlıklı olarak laboratuvarda yaygın olarak bulunan malzemelere dayanmaktadır. Yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıklar, mevcut modelleme yöntemlerimiz çoğunlukla erken gelişimsel aşamalardan ziyade yerleşik hastalık fenotiplerine odaklandığı için özel bir ilgi noktası haline gelmiştir. Embriyonik kök hücreler ve iPSC'ler çok hassas hücrelerdir.
İlk kez kullananlar nazik olmalı ve sabırlı olmalıdır. Bunlar uzun süreli kültürler olduğundan, baştan beri sabırlı olunmalıdır Başlamak için, bir dikiş ipliğine %70 etanol püskürtün ve dikiş ipliğini neşterin kör ucuyla yıpratarak PLGA mikrofilamentleri hazırlayın. Elyafı mikroskop altına yerleştirin.
Ve bir cetvel kullanarak, lifi 500 mikrometre ila bir milimetre uzunluğundaki iplikçiklerden oluşan parçalar halinde kesmeye başlayın. Toplamda yaklaşık 25 milimetre lif kesin ve filamentleri bir mililitre Antibiyotik-Antimikotik çözelti içeren 15 mililitrelik bir tüpe ekleyin. Daha sonra, davlumbazda, iyice karıştırmak için fiber çözeltisini 10 mililitre DMEM / F-12 ve vorteks ile seyreltin.
Ardından, 96 delikli bir plakanın üç kuyucuğuna 20 mikrolitre fiber çözeltisi ekleyin. Parlak alan mikroskobu kullanarak, kuyu başına lifleri sayın ve ortalamasını alın. Kuyucukları elyaf çözeltisi ile kuyu başına ortalama 5 ila 10 mikrofilamente seyreltin veya konsantre edin.
Daha önce kültürlenmiş indüklenmiş pluripotent kök hücreler% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştığında, hücreleri mikroskop altında 10 veya 20x büyütmede kontrol edin. Kolonilerin% 10'dan daha az spontan farklılaşma alanı gösterdiğinden emin olun. Ortamı bir pipetle aspire edin ve hücreleri bir kez DPBS ile yıkayın.
Daha sonra, kolonileri ayrıştırmak için 500 mikrolitre hücre ayrılma çözeltisi veya 0.5 milimolar EDTA ekleyin ve üç ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, her bir kuyucuğa bir mililitre taze E8 ortamı ekleyin ve tüm hücreleri ayırmak için yavaşça pipet yapın. Tüm hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir mililitre daha taze E8 ortamı ekleyin.
Ardından, hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 290 g'da döndürün. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini 50 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş E6 ortamının bir mililitresinde yeniden askıya alın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. ROCK inhibitörü ile desteklenmiş E6 ortamında istenen oturma yoğunluğuna sahip bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
Ardından, 96 delikli ultra düşük bir bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna 150 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Daha sonra, hücreleri toplamaya zorlamak için plakayı oda sıcaklığında üç dakika boyunca 290 g'da santrifüj edin. Daha sonra, embriyoid vücut oluşumu için% 5 karbondioksit ile nemlendirilmiş bir atmosferde plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.
24 saatlik inkübasyondan sonra, plakayı davlumbaza aktarın ve pipet ucunu kuyuya çok fazla indirerek embriyoid gövdesini aspire etmemeye dikkat ederek, bir pipet kullanarak ortamın 120 mikrolitresini dikkatlice aspire edin. Daha sonra, iki mikromolar XAV939 ile desteklenmiş 150 mikrolitre taze E6 ortamı ve her bir kuyucuğa SMAD inhibitörleri ekleyin. Plakayı inkübatöre geri aktarın ve ortamı günlük olarak inhibitörlerle desteklenmiş taze hazırlanmış E6 ile değiştirin.
İnkübasyonun yedinci gününde, tüm embriyoid cisimlerinin 550 ila 600 mikrometre çapa ulaşıp ulaşmadığını kontrol edin ve pürüzsüz, net bir kenar gösterin. Bu aşamada, hücre dışı bir matrise gömülmeye hazırdırlar. Organoidleri gömmek için, boş bir P200 kutusuna dört inç uzunluğunda bir termoplastik tavan filmi tabakası yerleştirerek çukurlu gömme tabakaları hazırlayın.
Daha sonra, 15 mililitrelik bir konik tüp veya 500 mikrolitrelik bir mikro santrifüj tüpü kullanın ve 12 veya istenen sayıda çukur yapmak için film tabakasını yavaşça deliklere bastırın. Daha sonra, film tabakasına% 70 etanol püskürtün ve UV ışığı açıkken davlumbazın içinde en az 30 dakika kurumasını bekleyin. Bu arada, yeterli miktarda bazal membran matrisini buz üzerinde çözün.
Daha sonra, geniş delikli bir P200 ucu kullanarak, 96 delikli plakadan her bir çukura bir embriyoid gövdesi aktarın. Normal bir pipet ucuyla mümkün olduğunca fazla ortamı çıkarın, ancak embriyoid gövdesinin kurumasına izin vermeyin. Daha sonra, düzenli olarak önceden soğutulmuş bir P200 ucu ile, her organoide yaklaşık 30 mikrolitre seyreltilmemiş membran matrisi ekleyin ve embriyo gövdesinin damlacığın merkezine mümkün olduğunca yakın olmasını sağlayın.
Tüm embriyoid cisimler matrise gömüldükten sonra, film tabakasını steril bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, membran matrisinin katılaşmasını sağlamak için Petri kabını% 5 karbondioksit ile nemlendirilmiş bir atmosferde 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Organoid farklılaşması için, hazırlanan farklılaştırma ortamının beş mililitresini, ultra düşük bir bağlantı 6 delikli plakanın bir kuyucuğuna A vitamini olmadan B-27 ile ekleyin.
Plakayı bir inkübatörde önceden 37 santigrat dereceye ısıtın. Membran matrisi katılaştıktan sonra, çukurları film tabakasının arkasından iterek gömülü embriyoid gövdelerini 6 delikli plakaya aktarın. Gerekirse, kuyudan bir mililitre ortam kullanın ve damlacıkları film tabakasından ayırmak için tabakanın üzerine borulayın.
Membran matriksindeki gömülü embriyoid cisimler, in vitro 10 gün boyunca farklı tomurcuklanma oluşumları gösteren serebral organoidlere doğru farklılaştı. İn vitro 30. günde, organoidler çukur veya sandviç gömme kullanılarak daha da olgunlaştırılır. Uzun süreli kültür, serebral organoidlerin önemli boyutlara büyüdüğünü gösterir.
İn vitro yedi günde, embriyoid cisimler SOX2 pozitif nöral rozetleri, dağınık olgunlaşmamış nöronları ve nöral progenitör hücreleri gösterir. Oysa gün geçtikçe in vitro 120, MAP2 ve NeuN gibi olgun nöronal belirteçler sergilerler. Bu sitoiskelet belirteçleri, sinaptik plastisite ve yaşa bağlı diğer düşüşlerin yanı sıra astrositler ve glia gibi ek beyin dokusunu araştırmak için doublekortin ve sinapsin gibi diğer postmitotik belirteçlerle birlikte kullanılabilir.
Dokunun kenarlarının sağlam kalmasını sağlamak çok önemlidir. Zararlı kesme kuvvetini en aza indirmek için, örneğin ortam ve organoid gömme değiştirilirken borulama yavaşça yapılmalıdır. Yavaşlamış organoid büyüme, hastalığın erken hücresel belirtilerde ilerlemesini incelememizi sağlar.
Organoid oluşumu birçok hastalığın tedavisinde erken teşhisin önünü açmaktadır.
